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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物做克隆，菌液涂平板后长得很慢是什么原因？
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] PCR产物做克隆，菌液涂平板后长得很慢是什么原因？ 已有5人参与

各位大虾：我现在要把PCR产物做克隆，菌复壮后（37℃摇菌1h），4000rpm离心数秒，留下约300ul的菌液，吹打均匀，取20-30ul涂平板，37℃培养17h左右菌落还是比较小，而且菌落数量并不多，请问可能会是什么原因啊？
ps：我之前做克隆，到这一步，情况是菌落密密麻麻还很小，这次减少了涂平板的菌液量，菌落是少了，但还是长得那么慢。
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越努力越幸运
1楼 2014-04-14 16:48:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-14 17:24:31
柠檬可乐星: 金币+2 2014-04-15 16:12:17
这个应该跟感受态有关系。DH5a的感受态37度12小时左右就挺大的了，10小时就可以挑。
我一般做DH5a是菌复壮后（37℃摇菌40-50min），6000rpm离心数秒，留下约100ul的菌液，吹打均匀涂平板，37℃培养至长得比较大。一般为12小时。
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2楼2014-04-14 17:10:26
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-18 11:08:18
这样5ul的体系可以吗？我是takala的pmd 18-t 载体，昨晚测了三十个，终于有四个是正确的
弱弱的问下，PCR过夜，怎么设置温度...

我一直用的这个体系，从最后结果来看，效果还是不错滴，你可以试试啊
不是pcr过夜，是把配好的连接体系放到pcr仪里，程序设置成16℃（仅此一步）时间嘛我都是设成∞，到时候自己收就是了，你晚上做了早上收，不就过夜啦。
今天我的测序结果出来了，还不错，都测出来了，之前挑的单克隆大部分也都是阳性的，菌落虽然小点儿但是结果还不错。
你在挑菌的时候，要捡大小合适（不要太大的）、远离菌落群的单菌落，还有你最后菌落PCR的时候，最好用自己的特异性引物做，降低假阳性的几率。
连接、转化每一步都严格把关，总会成功的
祝你好运
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越努力越幸运
15楼2014-04-18 19:20:36
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普通回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-18 12:33:05
应该是导入时候的成功率不高导致。有次做克隆放在冰上，没处理好，结果冻住了，阳性克隆子很少，长的也很慢。
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学习使你立于不败之地
3楼2014-04-14 17:32:17
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
柠檬可乐星: 金币+1 2014-04-15 16:10:29
很可能是感受态出问题了，换了感受态再试试

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4楼2014-04-14 18:18:15
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-04-14 17:10:26
这个应该跟感受态有关系。DH5a的感受态37度12小时左右就挺大的了，10小时就可以挑。
我一般做DH5a是菌复壮后（37℃摇菌40-50min），6000rpm离心数秒，留下约100ul的菌液，吹打均匀涂平板，37℃培养至长得比较大。一 ...

我跟你的操作是基本一样的 但是菌落长得比较小 后续实验倒是也能出结果  只是挑菌的时候 看着那么小 有些费劲
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越努力越幸运
5楼2014-04-15 16:08:55
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-04-14 17:32:17
应该是导入时候的成功率不高导致。有次做克隆放在冰上，没处理好，结果冻住了，阳性克隆子很少，长的也很慢。

阳性克隆子少 跟长得慢 应该没有关系吧 菌落不都是单克隆吗
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6楼2014-04-15 16:10:15
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-14 18:18:15
很可能是感受态出问题了，换了感受态再试试

买的takara的感受态 连接跟转化成功率倒是可以保证  就只是菌落长得比较慢这一个问题
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越努力越幸运
7楼2014-04-15 16:12:01
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yuren2009

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-15 16:10:15
阳性克隆子少 跟长得慢 应该没有关系吧 菌落不都是单克隆吗...

有关系的，你想下聚落也是单个菌组成的，何况你又加了抗生素。快慢也跟你的培养条件有很大关系。
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学习使你立于不败之地
8楼2014-04-15 16:32:48
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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柠檬可乐星: 金币+1 2014-04-15 21:22:55
感受态，抗生素的量等等一些过程细节，都需要确认是否有问题。。。
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9楼2014-04-15 18:45:07
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2014-04-15 18:45:07
感受态，抗生素的量等等一些过程细节，都需要确认是否有问题。。。

谢谢 下次减少抗生素的量试试
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10楼2014-04-15 21:23:43
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