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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] PCR产物做克隆,菌液涂平板后长得很慢是什么原因? 已有5人参与

各位大虾:我现在要把PCR产物做克隆,菌复壮后(37℃摇菌1h),4000rpm离心数秒,留下约300ul的菌液,吹打均匀,取20-30ul涂平板,37℃培养17h左右菌落还是比较小,而且菌落数量并不多,请问可能会是什么原因啊?
ps:我之前做克隆,到这一步,情况是菌落密密麻麻还很小,这次减少了涂平板的菌液量,菌落是少了,但还是长得那么慢。
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-04-14 17:24:31
柠檬可乐星: 金币+2 2014-04-15 16:12:17
这个应该跟感受态有关系。DH5a的感受态37度12小时左右就挺大的了,10小时就可以挑。
我一般做DH5a是菌复壮后(37℃摇菌40-50min),6000rpm离心数秒,留下约100ul的菌液,吹打均匀涂平板,37℃培养至长得比较大。一般为12小时。
2楼2014-04-14 17:10:26
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-18 11:08:18
这样5ul的体系可以吗?我是takala的pmd 18-t 载体,昨晚测了三十个,终于有四个是正确的
弱弱的问下,PCR过夜,怎么设置温度...

我一直用的这个体系,从最后结果来看,效果还是不错滴,你可以试试啊
不是pcr过夜,是把配好的连接体系放到pcr仪里,程序设置成16℃(仅此一步)时间嘛我都是设成∞,到时候自己收就是了,你晚上做了早上收,不就过夜啦。
今天我的测序结果出来了,还不错,都测出来了,之前挑的单克隆大部分也都是阳性的,菌落虽然小点儿但是结果还不错。
你在挑菌的时候,要捡大小合适(不要太大的)、远离菌落群的单菌落,还有你最后菌落PCR的时候,最好用自己的特异性引物做,降低假阳性的几率。
连接、转化每一步都严格把关,总会成功的
祝你好运
越努力越幸运
15楼2014-04-18 19:20:36
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普通回帖

yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-18 12:33:05
应该是导入时候的成功率不高导致。有次做克隆放在冰上,没处理好,结果冻住了,阳性克隆子很少,长的也很慢。
学习使你立于不败之地
3楼2014-04-14 17:32:17
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


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柠檬可乐星: 金币+1 2014-04-15 16:10:29
很可能是感受态出问题了,换了感受态再试试

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-04-14 18:18:15
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-04-14 17:10:26
这个应该跟感受态有关系。DH5a的感受态37度12小时左右就挺大的了,10小时就可以挑。
我一般做DH5a是菌复壮后(37℃摇菌40-50min),6000rpm离心数秒,留下约100ul的菌液,吹打均匀涂平板,37℃培养至长得比较大。一 ...

我跟你的操作是基本一样的 但是菌落长得比较小 后续实验倒是也能出结果  只是挑菌的时候 看着那么小 有些费劲
越努力越幸运
5楼2014-04-15 16:08:55
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yuren2009 at 2014-04-14 17:32:17
应该是导入时候的成功率不高导致。有次做克隆放在冰上,没处理好,结果冻住了,阳性克隆子很少,长的也很慢。

阳性克隆子少 跟长得慢 应该没有关系吧 菌落不都是单克隆吗
越努力越幸运
6楼2014-04-15 16:10:15
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-04-14 18:18:15
很可能是感受态出问题了,换了感受态再试试

买的takara的感受态 连接跟转化成功率倒是可以保证  就只是菌落长得比较慢这一个问题
越努力越幸运
7楼2014-04-15 16:12:01
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yuren2009

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-15 16:10:15
阳性克隆子少 跟长得慢 应该没有关系吧 菌落不都是单克隆吗...

有关系的,你想下聚落也是单个菌组成的,何况你又加了抗生素。快慢也跟你的培养条件有很大关系。
学习使你立于不败之地
8楼2014-04-15 16:32:48
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不爱做实验

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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柠檬可乐星: 金币+1 2014-04-15 21:22:55
感受态,抗生素的量等等一些过程细节,都需要确认是否有问题。。。
9楼2014-04-15 18:45:07
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2014-04-15 18:45:07
感受态,抗生素的量等等一些过程细节,都需要确认是否有问题。。。

谢谢 下次减少抗生素的量试试
越努力越幸运
10楼2014-04-15 21:23:43
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