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不爱做实验

银虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-15 21:23:43
谢谢 下次减少抗生素的量试试...

客气,一般是100ml空白培养基加100ul抗生素,你也可以参考别人的试试,祝顺利。。。
11楼2014-04-15 22:05:30
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樊樊

铜虫 (小有名气)

咱们做的内容很相似呀,我也是连接转化,挑菌,可是我假阳性率太高了,上次挑了四十个居然全部是假阳性,PCR估计是载体自连。这个就比较郁闷了。 另外,我的菌落长得也比较慢,大概的16h以后才可以调。我用的takara pmd18-t载体,说明书说的是16度半小时,可是我水浴半小时,最后结果是不长。后面调节4度过夜连接,长到时长了,就是出现了前面说的40个全部是假阳性……
  你连接用的什么载体,怎么控制温度的?连接比例也是5:3:1:1吗?
12楼2014-04-15 23:04:27
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-15 23:04:27
咱们做的内容很相似呀,我也是连接转化,挑菌,可是我假阳性率太高了,上次挑了四十个居然全部是假阳性,PCR估计是载体自连。这个就比较郁闷了。 另外,我的菌落长得也比较慢,大概的16h以后才可以调。我用 ...

takala的pmd 19-t,在pcr仪里16℃连接过夜,连接比例是2ulDNA,2.5ul solution,0.5ul 载体
越努力越幸运
13楼2014-04-18 10:14:36
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樊樊

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-18 10:14:36
takala的pmd 19-t,在pcr仪里16℃连接过夜,连接比例是2ulDNA,2.5ul solution,0.5ul 载体...

这样5ul的体系可以吗?我是takala的pmd 18-t 载体,昨晚测了三十个,终于有四个是正确的
弱弱的问下,PCR过夜,怎么设置温度
14楼2014-04-18 11:08:18
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-18 11:08:18
这样5ul的体系可以吗?我是takala的pmd 18-t 载体,昨晚测了三十个,终于有四个是正确的
弱弱的问下,PCR过夜,怎么设置温度...

我一直用的这个体系,从最后结果来看,效果还是不错滴,你可以试试啊
不是pcr过夜,是把配好的连接体系放到pcr仪里,程序设置成16℃(仅此一步)时间嘛我都是设成∞,到时候自己收就是了,你晚上做了早上收,不就过夜啦。
今天我的测序结果出来了,还不错,都测出来了,之前挑的单克隆大部分也都是阳性的,菌落虽然小点儿但是结果还不错。
你在挑菌的时候,要捡大小合适(不要太大的)、远离菌落群的单菌落,还有你最后菌落PCR的时候,最好用自己的特异性引物做,降低假阳性的几率。
连接、转化每一步都严格把关,总会成功的
祝你好运
越努力越幸运
15楼2014-04-18 19:20:36
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dispy

金虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-18 19:20:36
我一直用的这个体系,从最后结果来看,效果还是不错滴,你可以试试啊
不是pcr过夜,是把配好的连接体系放到pcr仪里,程序设置成16℃(仅此一步)时间嘛我都是设成∞,到时候自己收就是了,你晚上做了早上收,不就 ...

您好,我想问下我也是用takala的pmd 19-t载体,连了4个条带,只有两个菌落PCR有结果,另外两个没有跑出来,但是都是挑的白斑,难道是假阳性么?我链接用了2h,是时间太短了没连上?说明书说30min就可以啊?
16楼2014-05-06 00:26:53
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

DH5a长的时间在10-16个小时都比较正常,不用担心。
17楼2014-05-06 04:48:03
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ycyznxb

新虫 (初入文坛)

天,,我也是相同情况,求解决方法,一直不知道为什么

发自小木虫Android客户端
18楼2018-10-10 14:39:54
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