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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物做克隆，菌液涂平板后长得很慢是什么原因？
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-15 21:23:43
谢谢 下次减少抗生素的量试试...

客气，一般是100ml空白培养基加100ul抗生素，你也可以参考别人的试试，祝顺利。。。
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11楼2014-04-15 22:05:30
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樊樊

铜虫 (小有名气)
咱们做的内容很相似呀，我也是连接转化，挑菌，可是我假阳性率太高了，上次挑了四十个居然全部是假阳性，PCR估计是载体自连。这个就比较郁闷了。 另外，我的菌落长得也比较慢，大概的16h以后才可以调。我用的takara pmd18-t载体，说明书说的是16度半小时，可是我水浴半小时，最后结果是不长。后面调节4度过夜连接，长到时长了，就是出现了前面说的40个全部是假阳性……
  你连接用的什么载体，怎么控制温度的？连接比例也是5:3:1：1吗？
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12楼2014-04-15 23:04:27
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-15 23:04:27
咱们做的内容很相似呀，我也是连接转化，挑菌，可是我假阳性率太高了，上次挑了四十个居然全部是假阳性，PCR估计是载体自连。这个就比较郁闷了。 另外，我的菌落长得也比较慢，大概的16h以后才可以调。我用 ...

takala的pmd 19-t，在pcr仪里16℃连接过夜，连接比例是2ulDNA，2.5ul solution，0.5ul 载体
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越努力越幸运
13楼2014-04-18 10:14:36
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樊樊

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-18 10:14:36
takala的pmd 19-t，在pcr仪里16℃连接过夜，连接比例是2ulDNA，2.5ul solution，0.5ul 载体...

这样5ul的体系可以吗？我是takala的pmd 18-t 载体，昨晚测了三十个，终于有四个是正确的
弱弱的问下，PCR过夜，怎么设置温度
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14楼2014-04-18 11:08:18
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 樊樊 at 2014-04-18 11:08:18
这样5ul的体系可以吗？我是takala的pmd 18-t 载体，昨晚测了三十个，终于有四个是正确的
弱弱的问下，PCR过夜，怎么设置温度...

我一直用的这个体系，从最后结果来看，效果还是不错滴，你可以试试啊
不是pcr过夜，是把配好的连接体系放到pcr仪里，程序设置成16℃（仅此一步）时间嘛我都是设成∞，到时候自己收就是了，你晚上做了早上收，不就过夜啦。
今天我的测序结果出来了，还不错，都测出来了，之前挑的单克隆大部分也都是阳性的，菌落虽然小点儿但是结果还不错。
你在挑菌的时候，要捡大小合适（不要太大的）、远离菌落群的单菌落，还有你最后菌落PCR的时候，最好用自己的特异性引物做，降低假阳性的几率。
连接、转化每一步都严格把关，总会成功的
祝你好运
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越努力越幸运
15楼2014-04-18 19:20:36
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dispy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-18 19:20:36
我一直用的这个体系，从最后结果来看，效果还是不错滴，你可以试试啊
不是pcr过夜，是把配好的连接体系放到pcr仪里，程序设置成16℃（仅此一步）时间嘛我都是设成∞，到时候自己收就是了，你晚上做了早上收，不就 ...

您好，我想问下我也是用takala的pmd 19-t载体，连了4个条带，只有两个菌落PCR有结果，另外两个没有跑出来，但是都是挑的白斑，难道是假阳性么？我链接用了2h，是时间太短了没连上？说明书说30min就可以啊？
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16楼2014-05-06 00:26:53
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

DH5a长的时间在10-16个小时都比较正常，不用担心。
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17楼2014-05-06 04:48:03
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ycyznxb

新虫 (初入文坛)
天，，我也是相同情况，求解决方法，一直不知道为什么

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18楼2018-10-10 14:39:54
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