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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物做克隆，菌液涂平板后长得很慢是什么原因？
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] PCR产物做克隆，菌液涂平板后长得很慢是什么原因？已有5人参与

各位大虾：我现在要把PCR产物做克隆，菌复壮后（37℃摇菌1h），4000rpm离心数秒，留下约300ul的菌液，吹打均匀，取20-30ul涂平板，37℃培养17h左右菌落还是比较小，而且菌落数量并不多，请问可能会是什么原因啊？
ps：我之前做克隆，到这一步，情况是菌落密密麻麻还很小，这次减少了涂平板的菌液量，菌落是少了，但还是长得那么慢。
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越努力越幸运
1楼2014-04-14 16:48:51
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樊樊

铜虫 (小有名气)
咱们做的内容很相似呀，我也是连接转化，挑菌，可是我假阳性率太高了，上次挑了四十个居然全部是假阳性，PCR估计是载体自连。这个就比较郁闷了。 另外，我的菌落长得也比较慢，大概的16h以后才可以调。我用的takara pmd18-t载体，说明书说的是16度半小时，可是我水浴半小时，最后结果是不长。后面调节4度过夜连接，长到时长了，就是出现了前面说的40个全部是假阳性……
  你连接用的什么载体，怎么控制温度的？连接比例也是5:3:1：1吗？
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12楼2014-04-15 23:04:27
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樊樊

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-18 10:14:36
takala的pmd 19-t，在pcr仪里16℃连接过夜，连接比例是2ulDNA，2.5ul solution，0.5ul 载体...

这样5ul的体系可以吗？我是takala的pmd 18-t 载体，昨晚测了三十个，终于有四个是正确的
弱弱的问下，PCR过夜，怎么设置温度
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14楼2014-04-18 11:08:18
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