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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物做克隆，菌液涂平板后长得很慢是什么原因？
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[求助] PCR产物做克隆，菌液涂平板后长得很慢是什么原因？ 已有5人参与

各位大虾：我现在要把PCR产物做克隆，菌复壮后（37℃摇菌1h），4000rpm离心数秒，留下约300ul的菌液，吹打均匀，取20-30ul涂平板，37℃培养17h左右菌落还是比较小，而且菌落数量并不多，请问可能会是什么原因啊？
ps：我之前做克隆，到这一步，情况是菌落密密麻麻还很小，这次减少了涂平板的菌液量，菌落是少了，但还是长得那么慢。
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越努力越幸运
1楼 2014-04-14 16:48:51
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dispy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 柠檬可乐星 at 2014-04-18 19:20:36
我一直用的这个体系，从最后结果来看，效果还是不错滴，你可以试试啊
不是pcr过夜，是把配好的连接体系放到pcr仪里，程序设置成16℃（仅此一步）时间嘛我都是设成∞，到时候自己收就是了，你晚上做了早上收，不就 ...

您好，我想问下我也是用takala的pmd 19-t载体，连了4个条带，只有两个菌落PCR有结果，另外两个没有跑出来，但是都是挑的白斑，难道是假阳性么？我链接用了2h，是时间太短了没连上？说明书说30min就可以啊？
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16楼2014-05-06 00:26:53
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-04-14 17:24:31
柠檬可乐星: 金币+2 2014-04-15 16:12:17
这个应该跟感受态有关系。DH5a的感受态37度12小时左右就挺大的了，10小时就可以挑。
我一般做DH5a是菌复壮后（37℃摇菌40-50min），6000rpm离心数秒，留下约100ul的菌液，吹打均匀涂平板，37℃培养至长得比较大。一般为12小时。
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2楼2014-04-14 17:10:26
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-18 12:33:05
应该是导入时候的成功率不高导致。有次做克隆放在冰上，没处理好，结果冻住了，阳性克隆子很少，长的也很慢。
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学习使你立于不败之地
3楼2014-04-14 17:32:17
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
柠檬可乐星: 金币+1 2014-04-15 16:10:29
很可能是感受态出问题了，换了感受态再试试

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4楼2014-04-14 18:18:15
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