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哈皮Bingo

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于PCR连接后菌液鉴定的问题 已有10人参与

PCR连接完成后,质粒转化入感受态细胞培养出单菌落后,进行菌液鉴定并跑胶,出现的条带大小是不是应该是目的片段加两引物大小?
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luwei13566

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-13 18:15:41
跑电泳,条带有偏差很正常,原因很多,不要纠结。
我分享我的一个protocl,插入片段大于1000bp都能用。
1、连接转化后挑单克隆到500ul培养液中(用1.5mlEP管即可)
2、摇4-5h后,取80ul菌液。
3、80ul菌液+20ul ...

这种就是质粒快速检测。实际就是手提质粒的前几步,我以前试过效果不错,只是电泳图不如提取的质粒清楚而已。
大家相互帮助哈
6楼2014-05-13 18:34:32
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查看全部 19 个回答

猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-13 17:59:15
条带大小应该是你PCR目的片段加酶切后质粒之和,引物一般只有20几bp,建议你用提取出来的质粒为模版,用你PCR的上下游引物进行PCR,能P出条带说明连接上了,之后最好送去测序,看有没有位点突变。(你提问很模糊,你是不是就是做的菌液PCR?)
2楼2014-05-13 16:05:11
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亦逐日

金虫 (小有名气)

PCR连接完成?好难啊
道可道,非常道
3楼2014-05-13 16:18:46
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-13 17:59:33
看你用什么载体了,载体上两引物之间的距离加片段长度即可

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-05-13 17:32:57
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