应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于PCR连接后菌液鉴定的问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
191/2返回列表12下一页
查看: 3331  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

哈皮Bingo

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于PCR连接后菌液鉴定的问题 已有10人参与

PCR连接完成后，质粒转化入感受态细胞培养出单菌落后，进行菌液鉴定并跑胶，出现的条带大小是不是应该是目的片段加两引物大小？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-05-13 15:52:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

猪尾巴草

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-05-13 17:59:15
条带大小应该是你PCR目的片段加酶切后质粒之和，引物一般只有20几bp，建议你用提取出来的质粒为模版，用你PCR的上下游引物进行PCR，能P出条带说明连接上了，之后最好送去测序，看有没有位点突变。（你提问很模糊，你是不是就是做的菌液PCR？）
赞一下 回复此楼
2楼2014-05-13 16:05:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

亦逐日

金虫 (小有名气)
PCR连接完成？好难啊
赞一下 回复此楼
道可道，非常道
3楼2014-05-13 16:18:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-13 17:59:33
看你用什么载体了，载体上两引物之间的距离加片段长度即可

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
4楼2014-05-13 17:32:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

BioChen

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-05-14 09:06:48
跑电泳，条带有偏差很正常，原因很多，不要纠结。
我分享我的一个protocl，插入片段大于1000bp都能用。
1、连接转化后挑单克隆到500ul培养液中（用1.5mlEP管即可）
2、摇4-5h后，取80ul菌液。
3、80ul菌液+20ul裂解液（主要成分是SDS和NaOH，自己去网上着配方。可以用苯酚代替）+20ul loading buffer。
4、震荡15s，短暂离心。取20ul上清电泳。点样的时候，一定要点空质粒做对照。
一般会有4条带，从上到下依次为细菌基因组、质粒、28sRNA，18sRNA。和空质粒做对照，出现比空质粒跑的慢的带，即为阳性克隆。
5、送100ul菌液测序，订单上注明返质粒。连提质粒都省了。
赞一下 回复此楼
5楼2014-05-13 18:15:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by BioChen at 2014-05-13 18:15:41
跑电泳，条带有偏差很正常，原因很多，不要纠结。
我分享我的一个protocl，插入片段大于1000bp都能用。
1、连接转化后挑单克隆到500ul培养液中（用1.5mlEP管即可）
2、摇4-5h后，取80ul菌液。
3、80ul菌液+20ul ...

这种就是质粒快速检测。实际就是手提质粒的前几步，我以前试过效果不错，只是电泳图不如提取的质粒清楚而已。
赞一下 回复此楼
大家相互帮助哈
6楼2014-05-13 18:34:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

哈皮Bingo

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 猪尾巴草 at 2014-05-13 16:05:11
条带大小应该是你PCR目的片段加酶切后质粒之和，引物一般只有20几bp，建议你用提取出来的质粒为模版，用你PCR的上下游引物进行PCR，能P出条带说明连接上了，之后最好送去测序，看有没有位点突变。（你提问很模糊，你 ...

我是载体和目的片段连接这步做完后，转入感受态中，然后将培养出来的单克隆挑菌落出来加入到鉴定体系（包含上下游引物）中，反应完成加热后直接拿去跑胶
赞一下 回复此楼
7楼2014-05-13 19:05:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

哈皮Bingo

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-13 17:32:57
看你用什么载体了，载体上两引物之间的距离加片段长度即可

用的pET28a，什么叫载体上两引物之间的距离？
赞一下 回复此楼
8楼2014-05-13 19:07:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

906394648

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
哈皮Bingo(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-14 09:07:05
你可以自己双酶切跑胶看看，但是最好的是送去测序，生工和华大测序我都用过，还行，建议试试
赞一下 回复此楼
9楼2014-05-13 19:44:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

猪尾巴草

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 哈皮Bingo at 2014-05-13 19:05:25
我是载体和目的片段连接这步做完后，转入感受态中，然后将培养出来的单克隆挑菌落出来加入到鉴定体系（包含上下游引物）中，反应完成加热后直接拿去跑胶...

就是菌液PCR，条带是目的片段加两引物大小
赞一下 回复此楼
10楼2014-05-13 21:42:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 哈皮Bingo 的主题更新
191/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 327求调剂 +6 Xxjc1107. 2026-04-06 7/350 2026-04-08 01:15 by BruceLiu320
[考研] 材料工程专业日语生求调剂 +9 111623 2026-04-07 9/450 2026-04-07 23:31 by 一只好果子?
[考研] 070300化学学硕311分求调剂 +16 梁富贵险中求 2026-04-04 17/850 2026-04-07 22:11 by lijunpoly
[考研] 材料调剂 +17 小刘同学吖吖 2026-04-06 18/900 2026-04-07 11:41 by 诗与自由
[考研] 生物学学硕求调剂：351分一志愿南京师范大学生物学专业 +6 …～、王…～ 2026-04-06 7/350 2026-04-06 18:54 by macy2011
[考研] 一志愿安徽某211 0703化学总分339求调剂 +7 晚风不晚 2026-04-04 7/350 2026-04-06 14:06 by houyaoxu
[考研] 0855求调剂材料 +11 红桃灼灼 2026-04-04 12/600 2026-04-06 10:26 by 蓝云思雨
[考研] 320分人工智能调剂 +8 振—TZ 2026-04-03 8/400 2026-04-05 22:33 by 范式思维
[考研] 313求调剂 +5 海日海日 2026-04-04 7/350 2026-04-05 13:58 by imissbao
[考研] 材料与化工306分找调剂 +12 沧海轻舟e 2026-04-03 13/650 2026-04-04 23:45 by lqwchd
[考研] 278求调剂 +14 范婷娜 2026-04-04 15/750 2026-04-04 22:15 by lqwchd
[考研] 341求调剂 +3 洛多罗 2026-04-02 4/200 2026-04-04 21:36 by 智能智慧
[考研] 293求调剂 +5 末未mm 2026-04-02 6/300 2026-04-03 15:20 by 王保杰33
[考研] 一志愿北京交通大学材料工程总分358 +4 cs0106 2026-04-03 4/200 2026-04-03 13:41 by 百灵童888
[考研] 320求调剂 +3 农业工程与信息� 2026-04-03 3/150 2026-04-03 11:40 by 土木硕士招生
[考研] 求调剂 +7 Aniyaio 2026-04-02 7/350 2026-04-02 16:42 by zzsw+
[考研] 材料专硕322分 +11 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-01 11/550 2026-04-02 10:52 by lnilvy
[考研] 一志愿厦门大学化学工程（专硕）-数二英二406分-求调剂 +5 厦大化工 2026-04-01 5/250 2026-04-02 10:03 by jp9609
[考研] 生物学327，求调剂 +5 书上的梅子 2026-04-01 6/300 2026-04-02 06:47 by ilovexiaobin
[考研] 310分求调剂 +4 成功上岸wang 2026-04-01 4/200 2026-04-01 20:35 by liu823948201
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭