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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化后鉴定大小不对，求帮助！！！
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落枫林

无虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化后鉴定大小不对，求帮助！！！

我用Age I和 EcoR I酶切回收的PCR产物，得到1500bp的目的片段；用Age I 和EcoR I 酶切载体,得到749bp和9.2kb的片段，回收9.2kb的载体。16℃过夜连接，转化后菌落PCR鉴定，阳性条带应该是534bp，可是出来条带的都在2kb。鉴定引物分别是基因上和载体上的，没有序列上的重复。
        别人帮我重新做了一整个流程，结果也一样。抽过质粒，测序结果是空载体。
        这方面经验不足，真心求帮助！谢谢。
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1楼 2011-08-12 16:05:39
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peace12039088

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-12 18:04:47
落枫林(金币+5): 2011-08-15 09:18:41
建议对阳性克隆小样法提取质粒后做酶切鉴定。可以依然选用Age I和 EcoR I酶切，看是否可以得到1500bp与9.2kb的片段，也可以依据载体和目标片段的酶切位点选用新的内切酶做但单酶切或双酶切，但必须保证获得片段的条数与大小与预期相符。
还有提取质粒后再做一下PCR看一下，有时候菌落PCR的结果受很多未知因素影响，导致我们对结果难以理解。
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2楼2011-08-12 16:19:06
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peace12039088

银虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-12 19:19:05
忘记说了，多挑几个克隆抽质粒看看。你送几个样测序的？不知你转化后的菌落长的怎么样，用点热激还是电转。 我曾经抽提40个质粒酶切检测，才得到一个阳性克隆。还有你的目标片段有点大，如果此次不能得到阳性克隆，建议有电击转化。希望能给你提供点滴信息。
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3楼2011-08-12 16:26:41
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励下下 2011-08-12 19:19:40
落枫林(金币+2): 2011-08-19 09:45:01
上图吧。。。
考虑非特异性条带。。。
不过你可以提取质粒看看。。。然后再酶切一下。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-08-12 17:28:38
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米小爷

新虫 (初入文坛)
楼主  你有PCR和胶回收以及构建重组质粒等的具体操作步骤没？跪求啊
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5楼2015-01-20 15:40:32
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