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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 为什么菌液PCR的条带比目的基因小很多。
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anna87

新虫 (初入文坛)

[求助] 为什么菌液PCR的条带比目的基因小很多。已有5人参与

目的基因1600多bp。切胶回收连PMD-18T载体,转化DH5α，挑白斑摇菌，做PCR,出现的条带在250bp左右，没有出现目的条带，为什么？
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1楼2013-12-16 17:22:25
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-16 21:57:30
没有转进去，空载PCR到的片段差不多是250bp左右
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借你一生好不好
2楼2013-12-16 20:09:08
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-01-07 08:47:43
载体自连，多挑几个白斑，一般挑十个，这样就保险了。
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我不会！
3楼2013-12-16 23:45:20
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anna87

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 不叶珏 at 2013-12-16 20:09:08
没有转进去，空载PCR到的片段差不多是250bp左右

菌液PCR可以用自己的引物吗？还是要用通用引物，比如说PMD18-T,用M13？
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4楼2013-12-19 10:38:14
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anna87

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-16 23:45:20
载体自连，多挑几个白斑，一般挑十个，这样就保险了。

挑了  还是没有，、
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5楼2013-12-19 10:38:45
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露水无痕

新虫 (初入文坛)
就是没转进去，重新连接转化   将平板放在4度里看有没有假阳性的 另外  破菌会好些
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6楼2013-12-19 10:53:16
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by anna87 at 2013-12-19 10:38:14
菌液PCR可以用自己的引物吗？还是要用通用引物，比如说PMD18-T,用M13？...

可以用通用引物
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借你一生好不好
7楼2013-12-19 11:10:19
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-07 08:47:50
菌液pcr假阳性太多，不建议使用
之所以片段大小不对，因为你的模板就不干净了
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修身、齐家、治国、平天下
8楼2014-01-03 17:00:41
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生科院404

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-07 08:48:14
建议你再做一次转化，我之前转过一个150bp的基因试了三次才成功呢。
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9楼2014-01-05 20:22:50
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lxy1961

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-07 08:48:17
应该是连接效率不高，建议你选一个连接效率高的T4连接酶，天津强微特生物公司的连接酶就不错，还便宜。他们还有快连试剂盒，就是贵了点，不过效果真的不错，5分钟就都连上了。
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10楼2014-01-06 16:22:34
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