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anna87

新虫 (初入文坛)

[求助] 为什么菌液PCR的条带比目的基因小很多。 已有5人参与

目的基因1600多bp。切胶回收连PMD-18T载体,转化DH5α,挑白斑摇菌,做PCR,出现的条带在250bp左右,没有出现目的条带,为什么?
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-16 21:57:30
没有转进去,空载PCR到的片段差不多是250bp左右
借你一生好不好
2楼2013-12-16 20:09:08
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三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-01-07 08:47:43
载体自连,多挑几个白斑,一般挑十个,这样就保险了。
我不会!
3楼2013-12-16 23:45:20
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anna87

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 不叶珏 at 2013-12-16 20:09:08
没有转进去,空载PCR到的片段差不多是250bp左右

菌液PCR可以用自己的引物吗?还是要用通用引物,比如说PMD18-T,用M13?
4楼2013-12-19 10:38:14
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anna87

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 三蛰 at 2013-12-16 23:45:20
载体自连,多挑几个白斑,一般挑十个,这样就保险了。

挑了  还是没有,、
5楼2013-12-19 10:38:45
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露水无痕

新虫 (初入文坛)

就是没转进去,重新连接转化   将平板放在4度里看有没有假阳性的 另外  破菌会好些
6楼2013-12-19 10:53:16
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不叶珏

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by anna87 at 2013-12-19 10:38:14
菌液PCR可以用自己的引物吗?还是要用通用引物,比如说PMD18-T,用M13?...

可以用通用引物
借你一生好不好
7楼2013-12-19 11:10:19
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-07 08:47:50
菌液pcr假阳性太多,不建议使用
之所以片段大小不对,因为你的模板就不干净了
修身、齐家、治国、平天下
8楼2014-01-03 17:00:41
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生科院404

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-01-07 08:48:14
建议你再做一次转化,我之前转过一个150bp的基因试了三次才成功呢。
9楼2014-01-05 20:22:50
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lxy1961

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-01-07 08:48:17
应该是连接效率不高,建议你选一个连接效率高的T4连接酶,天津强微特生物公司的连接酶就不错,还便宜。他们还有快连试剂盒,就是贵了点,不过效果真的不错,5分钟就都连上了。
10楼2014-01-06 16:22:34
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