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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 菌液pcr总是做不出！求高手解答！
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winnerfc

新虫 (小有名气)

[交流] 菌液pcr总是做不出！求高手解答！

我用takara的rTAQ酶做菌液PCR，总是没有目的条带，只有引物带，抽质粒酶切鉴定后证明是有阳性菌的，可是菌液pcr上没有条带。
           
            我用的体系如下： rtaq酶   5ul，引物1  0.2ul，引物2  0.2ul，菌液  1ul ，去离子水   3.6ul。 pcr程序就是用的rtaq酶说明书上的程序。（我换了一个高保真的酶也做过，是可以扩出目的条带的）

到底问题出在哪里呢？
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1楼 2013-11-01 09:38:00
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肖颖2009

铁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
wizardfan: 金币+2, 谢谢参与 2013-11-02 10:22:13
winnerfc: 金币+5 2013-11-02 11:29:37
你可以用质粒作为模板来扩，质粒需要稀释，根据跑胶浓度来确定怎么稀释。一般是稀释50~100倍。有时候因为仪器或者程序设置原因导致菌液里的菌体细胞壁不能完全破坏，不能释放出DNA，没有模板的话肯定扩不出来的。可以试试，等你好消息！
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2楼2013-11-01 11:44:05
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普通回帖

肖颖2009

铁虫 (正式写手)
★ ★
wizardfan: 金币+2, 大家来找茬 2013-11-02 10:22:48
哦 对了   你的这个体系有问题啊   应该还有dNTP  和 酶配套的buffer吧？
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3楼2013-11-01 11:45:23
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cccooo000

禁虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-11-02 10:22:24
本帖内容被屏蔽
4楼2013-11-01 16:40:38
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zhaoxr0311

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-11-02 10:23:05
酶是加的有点多，引物也不是硬要按说明书的，也有量的限制，试一下梯度扩增吧，一般菌落PCR很好出东西的
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5楼2013-11-01 17:11:55
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sun_in_night

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我觉得是不应该拿菌液做模板，1ul里面的菌太少了，除非你离心后再增加浓度了。其实还是菌落里面的菌多，所以直接菌落PCR就行。
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6楼2013-11-02 03:20:40
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jinwei331

至尊木虫 (文坛精英)
…………………………
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7楼2013-11-02 06:54:47
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winnerfc

新虫 (小有名气)
★
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2013-11-02 14:22:52
引用回帖:
2楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2013-11-01 11:44:05
你可以用质粒作为模板来扩，质粒需要稀释，根据跑胶浓度来确定怎么稀释。一般是稀释50~100倍。有时候因为仪器或者程序设置原因导致菌液里的菌体细胞壁不能完全破坏，不能释放出DNA，没有模板的话肯定扩不出来的。可 ...

你说得对！我先把菌液稀释了十倍，在pcr上95°跑了五分钟，之后离心取上清1ul，再做菌液pcr是可以扩出条带的！我估计之前是因为菌液没有完全破壁才扩不出来的。
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9楼2013-11-02 11:29:28
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winnerfc

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肖颖2009 at 2013-11-01 11:45:23
哦 对了   你的这个体系有问题啊   应该还有dNTP  和 酶配套的buffer吧？

rtaq酶是mix的。。。
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10楼2013-11-02 11:29:58
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winnerfc

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cccooo000 at 2013-11-01 16:40:38
rTaq酶的量也太多了，我一般只用1~2ul，还有，你的buffer呢。。。

takara的rtaq酶是mix酶，没有buffer。。。
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12楼2013-11-02 11:34:37
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[残月]

新虫 (初入文坛)
★
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确定你的引物没问题吗？
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13楼2013-11-02 19:01:45
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winnerfc

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by [残月] at 2013-11-02 19:01:45
确定你的引物没问题吗？

引物是用的扩增片段的引物，引物上添加了酶切位点，这个有影响吗？
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15楼2013-11-02 21:58:09
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dllchina

木虫 (著名写手)
★
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楼主这体系里酶浓度过高，菌液不知道你是怎么配置的，一般50微升体系只用加1微克，我也不清楚是多少，就是一点点，轻轻粘一下，还有dNTP要记得加过镁离子的才能用，酶用之前再拿出来，不要在室温放太久。
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16楼2013-11-03 21:38:43
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winnerfc

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by dllchina at 2013-11-03 21:38:43
楼主这体系里酶浓度过高，菌液不知道你是怎么配置的，一般50微升体系只用加1微克，我也不清楚是多少，就是一点点，轻轻粘一下，还有dNTP要记得加过镁离子的才能用，酶用之前再拿出来，不要在室温放太久。

我用的酶是混合体系的，dntp等都在里面了，你可以上takara的网上详细看看rtaq酶
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17楼2013-11-04 16:12:10
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
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菌液PCR的预扩增，温度设高点95-97，先来5-8min，保证破胞吧。
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18楼2013-11-08 15:01:29
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jonew

木虫 (正式写手)
★
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4楼: Originally posted by cccooo000 at 2013-11-01 16:40:38
rTaq酶的量也太多了，我一般只用1~2ul，还有，你的buffer呢。。。

这应该是个MIX吧
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19楼2013-12-21 12:43:41
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sjmr12218楼
2013-11-02 07:21   回复  
winnerfc11楼
2013-11-02 11:31   回复  
引用回帖:
7楼: Originally posted by jinwei331 at 2013-11-02 06:54:47 …………………………

ohcesc14楼
2013-11-02 19:41   回复  
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