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hajierlove

铜虫 (正式写手)

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[求助] 菌液pcr,坐等求助已有7人参与

今天做的菌液pcr，三个基因挑了48个单克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出来的目的条带都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能证明没有连接上吗？

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踏实

1楼 2014-07-23 20:33:08

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usky_4

银虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

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hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:19
gyesang: 回帖置顶 2014-07-24 17:00:14

你说条带是同一孔有250+750还是有的是250有的是750？胶图片可以放上来看一下
通用引物一般距离连接点都有几十个bp的距离，上下游加起来差个一两百是可能的，750bp有可能是对的
做菌液pcr最好是用通用引物和你的引物混搭，比如用通用上游引物和你的基因片段下游引物，当然这样子会导致你得到的阳性克隆减少一半。因为这是定向pcr，如果你的ORF克隆到载体里面是反向的话不会被扩增。但是应该可以给你足够多的阳性克隆了。换别的搭配也行，这样子的话准确性会高一些