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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 菌液pcr,坐等求助
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

[求助] 菌液pcr,坐等求助 已有7人参与

今天做的菌液pcr，三个基因挑了48个单克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出来的目的条带都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能证明没有连接上吗？
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踏实
1楼 2014-07-23 20:33:08
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胡亚梅

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:32
引物特异性不行啊，建议自己根据目的条带设计会更靠谱一些
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小虫虫~~
3楼2014-07-23 21:40:31
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
你用自己的引物跑p呀！干嘛用m13

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好好搞学术
2楼2014-07-23 21:26:20
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:40
做阴性对照了吗？用的是什么T载体？查下通用引物之间的距离。
应该是连接转化成功了，M13通用引物扩增空载体的产物大小一般是200bp左右。这样加上你的目的片段大小应该就是对的。
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4楼2014-07-23 22:23:16
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:31:49
你的载体是哪个牌子的？如果是pMD19-T的话一般用M13通用引物的话除了你的目的基因在基因两端会多扩出150bp以上的一段载体片段，所以你的那个750bp的片段可能是对的，而你的那个250bp的片段可能扩的是空载体。
拿你扩增出750bp片段的菌再用你扩基因的引物做个菌落PCR，或者直接提取质粒双酶切验证都可以，只要大小正确就可以去测序了。
赞一下(2人) 回复此楼
大家相互帮助哈
5楼2014-07-23 22:37:42
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