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hajierlove

铜虫 (正式写手)

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[求助] 菌液pcr,坐等求助已有7人参与

今天做的菌液pcr，三个基因挑了48个单克隆，做菌液pcr，引物是M13通用引物，出来的目的条带都是250bp。750bp。目的片段是500bp。怎么回事？只能证明没有连接上吗？

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踏实

1楼 2014-07-23 20:33:08

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

凌波丽

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励回帖交流 2014-07-24 09:32:22

个人意见，刚写出来的，边想边写，可能有错，仅供参考。

菌液PCR的假阳性的原因和解决方法(凌波丽，2014年7月24日)

1.建议楼主做阴性对照，阳性对照，检查是否存在污染。
2.假阳性可能的来源是未能和载体连接上的插入片段，这不相当于普通PCR的模板提取的那一步，这步的关键可能是保证挑的细菌克隆的确都能保证是阳性克隆。
3.菌液PCR假阳性也可能是引物设计有问题，引起不专一性PCR扩增。
4.可以加强DNA聚合酶的专一性（这步和普通PCR相同）：
（1）Taq DNA聚合酶的专一性扩增不够。改用专一性更强的DNA聚合酶，或者使用两种不同的DNA聚合酶，减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时，酶量不要太大，以免出现特异性扩增。
（2）酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入菌液PCR反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油。
（3）在反应体系中加入：1.0mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率，两者可以稳定 DNA聚合酶。
5.是否存在菌液PCR的反应体系之外的DNA污染源
菌液PCR的反应体系被污染：这种污染有两种原因：
第一种可能：大片段的交叉污染，导致非特异性带出现。
这种非特异性带出现可用以下方法解决：
（1）在加样枪的接头和吸杆之间加上脱脂消毒棉花，防止以前操作时将其他的DNA靶序列吸入加样枪内。
（2）除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
（3）所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
第二种可能：空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。有时候可能会互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致非特异性带出现的产生。虽然这样的可能性比较小。
对策：实验前对实验室充分通风，试验时尽量加上PCR试剂暴露于空气中的时间。
6.反应体系过大，模板DNA和非模板DNA过多引起了非特异性扩增。
7.目的DNA模板可能本身存在某些问题，比如与一些蛋白质发生了较牢固的结合（特异性或者非特异性）-----因为细菌也有类核，而这样的结合在裂解细菌由于某些因素没有去除，或者目的DNA模板的拓扑结构有某些问题。第7点只是我从细菌分子生物学角度做的猜测。第7条成为原因的可能性极小。
因为如果挑的阳性克隆没有问题，同时PCR的引物也肯定能够与目的模板互补的话，那么出现目的DNA扩增片段应该不是问题，也可能有非特异性扩增存在，但是只有非特异性扩增的话，所以此时就要考虑什么原因阻止了目的DNA的扩增。
8.引物的特异性差，受非特异性的PCR扩增的竞争性抑制作用的影响，靶基因的PCR扩增效率低，特异性的PCR产物极少。第1条措施到第6条措施均无效，则必须考虑重新设计引物。