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swach铁虫 (小有名气)
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PCR条带很暗，还有非特异性扩增，是什么问题 已有4人参与
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扩增nosZ基因，引物是 nosZ-F( 5'-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3') 和nosZ1622R( 5'-CGSACCTTSTTGCCSTYGCG-3') 扩增条件为95℃60s;95℃15s，53℃15s，72℃45s，循环40次。 体系为20微升，引物各1微升，模板分别为1和2微升。 电泳点样5微升，110V，30min。电泳图附件，条带很暗，是扩增条件不合适，还是引物不合理呢？谢谢大家  nosz0.jpg |
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【答案】应助回帖
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1、提供的信息不明确、不具体：例如模板和引物用量1微升，读者无法判断引物浓度到底是多少，也不知道模板的量到底是多少。 2、就现有结果而言，是否有你的产物？换句话说，你的扩增产物是多大？图中几条带都是特异性产物？还是根本没有你要的？ 3、你用的引物是degenerated primers。这种情况扩增起来有时比较复杂。从你现有的情况看，annealing温度不合适,可能太低。 4、建议：由于所用引物的特性，可以考虑开始时用较高退火温度，确保特异性，然后逐渐降低退火温度的方法。举例说： 第一循环：96C 20s, 65C 30s, 72C 30s; 第二循环：96C 20s， 62C 30s， 72C 35s； 第三循环：96C 20s，59C 30s， 72C 40s；然后： 四个循环：96C 20s，56C 30s， 72C 45s； 五个循环： 96C 20s，53C 30s， 72C 50s； 二十五个循环： 94C 20s，50C 45s， 72C 60s； 最后： 通过上述措施，可以保证产物的特异性。只要扩增条件合适，产物的量自然就多了。 |
6楼2014-07-20 10:37:58
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