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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 实验技术 » 求助：ISSR扩增条带问题解决
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)

[求助] 求助：ISSR扩增条带问题解决 已有1人参与

各位大神好，本人最近在做ISSR的分子标记，有几个问题想求助：1、扩增不同地区的植物样本如图，扩增产物跑胶后，总是看着有白色的拖尾，且条带之间不如文章上附图那么清晰可辨，不知道是什么原因；2、跑出来的条带会呈现成哑铃型，有时候一排胶跑的还呈现波浪状状，不明白什么原因，请大神指点！
求助：ISSR扩增条带问题解决
hp 2014-01-14.jpg


求助：ISSR扩增条带问题解决-1
hp 2014-01-16 xjy-pcr-4.jpg
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1楼 2014-02-27 22:08:36
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xujingyuanxu: 金币+10, ★★★很有帮助 2014-02-28 21:51:15
哑铃状第一是上样量少了，还有就是胶做好的时间比较长，有点干了。您可以先把胶放在电泳池中泡一下再上样，可能会好一点。
拖尾是由于PCR的问题，有些污染吧。您看您有的梳孔处都有亮点，这很可能是某些污染。
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2楼2014-02-27 23:08:06
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 新人小玥 at 2014-02-27 23:08:06
哑铃状第一是上样量少了，还有就是胶做好的时间比较长，有点干了。您可以先把胶放在电泳池中泡一下再上样，可能会好一点。
拖尾是由于PCR的问题，有些污染吧。您看您有的梳孔处都有亮点，这很可能是某些污染。

谢谢您！我在提取DNA的过程中，除蛋白用的是氯仿—异戊醇，没有加酚，是不是处理蛋白不彻底啊？其次，我没有用RNA酶处理，您觉得有什么影响么？RNA会不会放一段时间就自动降解了啊？第三，我PCR之前模板只是上了电泳，和marker进行对比，没有用吸光度测浓度，另外模板有时会特别亮，梳孔处有亮点，是因为蛋白还是多糖杂质呢？稀释一下可以么？谢谢您的帮忙！
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3楼2014-02-28 21:50:14
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新人小玥

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2014-02-28 21:50:14
谢谢您！我在提取DNA的过程中，除蛋白用的是氯仿—异戊醇，没有加酚，是不是处理蛋白不彻底啊？其次，我没有用RNA酶处理，您觉得有什么影响么？RNA会不会放一段时间就自动降解了啊？第三，我PCR之前模板只是上了电 ...

您PCR中加入的DNA模版量已经很低了，再加上反应体系进一步稀释。有杂质什么的也都被稀释了吧。。。。
没有用RNA酶处理没关系，不影响ISSR实验结果。另外您说的RNA降解一般都这么说，应该会被降解了吧，不过不好说
跑DNA时梳孔处的亮点可能蛋白多糖多酚什么的都有可能，如果不影响实验结果，就不用纠结。
我觉得您的关键点是在PCR上，做ISSR时就是DNA提的再烂都能做出来的，别纠结提DNA的方法了。好好看看PCR反应有没有可能引入什么污染。尤其是水！
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4楼2014-03-01 06:28:30
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 新人小玥 at 2014-03-01 06:28:30
您PCR中加入的DNA模版量已经很低了，再加上反应体系进一步稀释。有杂质什么的也都被稀释了吧。。。。
没有用RNA酶处理没关系，不影响ISSR实验结果。另外您说的RNA降解一般都这么说，应该会被降解了吧，不过不好说 ...

哦！原来是这样子啊，谢谢您！我想知道PCR反应一般可能会有哪些污染啊？例如说是PCR试剂交叉使用污染、实验室空气不干净、加样的时候枪头污染，还是有什么特别容易引入污染的？我是新人，还望指点！另外，我们的灭菌双蒸水都是灭菌后装在2ml的离心管里，然后放在-20度的冰箱里冻存，用的时候提前拿出来，当然一次没用完的就放在4度冰箱里保存，下次再用，这样是不是会污染水啊？
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5楼2014-03-01 21:42:40
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张-君

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2014-03-01 21:42:40
哦！原来是这样子啊，谢谢您！我想知道PCR反应一般可能会有哪些污染啊？例如说是PCR试剂交叉使用污染、实验室空气不干净、加样的时候枪头污染，还是有什么特别容易引入污染的？我是新人，还望指点！另外，我们的灭 ...

您好，我刚接触ISSR，但是一直p不出东西，跑不出条带来，能知道下您的PCR加样的体系吗？多谢
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我思故我在
6楼2014-11-10 14:41:43
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莫夏的亲妈

新虫 (初入文坛)
同求，我提取的DNA没有问题，但是PCR出来的结果不尽如人意，只有一条带，想问这是怎么一回事
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7楼2014-12-03 12:57:21
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xujingyuanxu

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 莫夏的亲妈 at 2014-12-03 12:57:21
同求，我提取的DNA没有问题，但是PCR出来的结果不尽如人意，只有一条带，想问这是怎么一回事

我觉得还是你的引物可能有问题！根据文献上的实验条件试试
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8楼2014-12-04 12:56:40
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莫夏的亲妈

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xujingyuanxu at 2014-12-04 12:56:40
我觉得还是你的引物可能有问题！根据文献上的实验条件试试...

谢谢，我换了另一种引物，就是有条带，但不是好多，只有两三条，能说明问题吗？还有做issr的酶有特殊要求吗
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9楼2014-12-18 14:39:24
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