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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做了一周的RAPD，几乎没p出条带，为啥？
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)

[交流] 做了一周的RAPD，几乎没p出条带，为啥？

用SDS-CTAB法提尖孢镰刀菌DNA，做RAPD，一周试了20条随机引物，有一条引物p出条带，相同条件做重复，就没条带出现，咋回事啊？
25微升扩增体系；10倍缓冲液2.5微升，dNTPs 2微升，Taq酶 0.125微升，引物 模板DNA各1微升，ddH2O 18.375微升，
扩增程序：
95度 2min，37度 1min，72度 2min，1个循环
94度1min，36度 1min，72度 2min，39个循环
94度1敏， 36度1min，72度 10min，1个循环，
谁能给个解释啊
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1楼 2012-04-14 18:39:07
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menglinyan

新虫 (小有名气)
★
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烦死了 我也没条带，半个月了
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3楼2012-04-15 14:21:09
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menglinyan

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你这两天做出来了吗，我已经降低了模板浓度了，提高了退货温度，还是没有条带，怎么会这样呢。。。哎 已经快要崩溃了
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5楼2012-04-16 17:27:42
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uuu555000

捐助贵宾 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by menglinyan at 2012-04-16 17:27:42:
你这两天做出来了吗，我已经降低了模板浓度了，提高了退货温度，还是没有条带，怎么会这样呢。。。哎 已经快要崩溃了

没啊  郁闷死了
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6楼2012-04-16 18:13:04
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menglinyan

新虫 (小有名气)
★ ★
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西瓜: 金币+1, 鼓励交流。 2012-04-18 18:08:58
引用回帖:
6楼: Originally posted by uuu555000 at 2012-04-16 18:13:04:
没啊  郁闷死了

楼主， 你找你们那边的师兄师姐帮你看一下，我昨天找了个做过这个的师兄指点了下。原来我的MIX没有按比例加，我跑的15微升体系，一直加的是6微升，后来加7.5微升，换了一次性的PCR管后就出来了，只是不知道稳定不。还有变性时间我也从3min延长到5min了
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7楼2012-04-18 16:03:37
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chenguestc

木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-02 13:44:14
提取DNA之后，可以跑个胶和测一下浓度看质量，此外，测浓度也可以知道你的DNA浓度是否合适。
你的缓冲液里有镁离子嘛？如果有，请试一下把BUFFER和镁离子分别加，调节一下镁离子含量。
反应前加一个预变性5分钟。
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8楼2012-05-02 11:09:52
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果上述的方法还没有效果的话，你试一下更换引物,我师弟做这个，他是前一百个引物效果还可以，有带。后一百个总是跑空板，也找不出什么原因，你试试多更换几个引物
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10楼2012-05-03 10:06:31
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xul58700901

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-04 13:32:54
一周才筛20条，最少100条RAPD随机引物筛选吧！先跑下DNA，看有问题没，在慢慢筛引物吧！不行搞个梯度PCR试试。
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11楼2012-05-03 18:14:57
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shange5112楼
2012-04-14 19:14   回复  
浪情无情4楼
2012-04-15 15:50   回复  
顶一下
dennydong9楼
2012-05-02 14:43   回复  
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