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子潇杨帆

金虫 (初入文坛)

[求助] 求助！！！筛选分子标记体系中的PCR问题

我采用SCoT分子标记法对某个植物材料的扩增体系进行筛选优化，建立了体系所需的5因素（模板，镁离子，dNTP，引物，Taq酶）4水平共16个组合的梯度筛选体系，如下所列：
        Mg2+浓度/ mmol /L         dNTPs浓度/mmol /L         Taq 聚合酶浓度/U         引物浓度/μmol/ L         模板DNA 浓度/ng/μl
  1               1.5                                     0.20                                0.5                          0.5                                     1.0
  2               2.0                                     0.25                                1.0                          0.6                                     1.5
  3               2.5                                     0.30                                    1.5                          0.7                                     2.0
  4           3.0                                     0.35                                    2.0                          0.8                                     2.5
扩增程序为: 94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共 32个循环；72℃最后延伸10 min。PCR 产物在0.8 %琼脂糖凝胶，l×TAE缓冲液条件下电泳， 染色后观察。电泳条件为电压120，电流190，功率40
现在连续尝试了4次，结果每次的电泳图全是很严重的弥散状，有的连MARKer都弥散了，看不清楚，请问懂这方面的师兄师姐哪位能给指点一下，我的问题出在哪儿？已经有各因素的浓度梯度设置了，是不是只能从扩增程序的改变上先尝试解决弥散的问题，比如提高退火温度，减少循环数等？这两个措施我已经尝试过了，然后效果并不好，还是弥散。。。是不是模板的质量不好，也会有弥散的情况出现？哪位前辈做过这类实验的能给指点指点吧？实在不知道问题出在哪儿，也不知道该怎样改进，不知道该怎样向下进行下一步试验了。。。。。。谢谢各位了！！！！！！
求助！！！筛选分子标记体系中的PCR问题
11-7（筛）1.jpg


求助！！！筛选分子标记体系中的PCR问题-1
11-7（筛2）1.jpg
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1楼 2013-11-09 17:53:03
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
子潇杨帆: 金币+1, ★有帮助 2013-11-27 08:14:05
连marker都弥散，是不是摄像的聚焦问题？
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2楼2013-11-10 11:18:33
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
试一下在凝胶前加EB，可能是染色的问题。
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3楼2013-11-10 11:20:45
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子潇杨帆

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2013-11-10 11:20:45
试一下在凝胶前加EB，可能是染色的问题。

好的，谢谢！我会试一下的~
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4楼2013-11-10 15:14:09
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