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[求助]
求助！！！筛选分子标记体系中的PCR问题
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我采用SCoT分子标记法对某个植物材料的扩增体系进行筛选优化，建立了体系所需的5因素（模板，镁离子，dNTP，引物，Taq酶）4水平共16个组合的梯度筛选体系，如下所列： Mg2+浓度/ mmol /L dNTPs浓度/mmol /L Taq 聚合酶浓度/U 引物浓度/μmol/ L 模板DNA 浓度/ng/μl 1 1.5 0.20 0.5 0.5 1.0 2 2.0 0.25 1.0 0.6 1.5 3 2.5 0.30 1.5 0.7 2.0 4 3.0 0.35 2.0 0.8 2.5 扩增程序为: 94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共 32个循环；72℃最后延伸10 min。PCR 产物在0.8 %琼脂糖凝胶，l×TAE缓冲液条件下电泳， 染色后观察。电泳条件为电压120，电流190，功率40 现在连续尝试了4次，结果每次的电泳图全是很严重的弥散状，有的连MARKer都弥散了，看不清楚，请问懂这方面的师兄师姐哪位能给指点一下，我的问题出在哪儿？已经有各因素的浓度梯度设置了，是不是只能从扩增程序的改变上先尝试解决弥散的问题，比如提高退火温度，减少循环数等？这两个措施我已经尝试过了，然后效果并不好，还是弥散。。。是不是模板的质量不好，也会有弥散的情况出现？哪位前辈做过这类实验的能给指点指点吧？实在不知道问题出在哪儿，也不知道该怎样改进，不知道该怎样向下进行下一步试验了。。。。。。谢谢各位了！！！！！！  11-7（筛）1.jpg  11-7（筛2）1.jpg |
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