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子潇杨帆

金虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 579.5
帖子: 10
在线: 4.4小时
虫号: 2723219
注册: 2013-10-14
专业: 园林学

[求助] 求助！！！筛选分子标记体系中的PCR问题

我采用SCoT分子标记法对某个植物材料的扩增体系进行筛选优化，建立了体系所需的5因素（模板，镁离子，dNTP，引物，Taq酶）4水平共16个组合的梯度筛选体系，如下所列：
Mg2+浓度/ mmol /L    dNTPs浓度/mmol /L Taq 聚合酶浓度/U    引物浓度/μmol/ L    模板DNA 浓度/ng/μl
  1          1.5                               0.20                               0.5                   0.5                               1.0
  2          2.0                               0.25                               1.0                   0.6                               1.5
  3          2.5                               0.30                               1.5                   0.7                               2.0
  4          3.0                               0.35                               2.0                   0.8                               2.5
扩增程序为: 94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共 32个循环；72℃最后延伸10 min。PCR 产物在0.8 %琼脂糖凝胶，l×TAE缓冲液条件下电泳，染色后观察。电泳条件为电压120，电流190，功率40
现在连续尝试了4次，结果每次的电泳图全是很严重的弥散状，有的连MARKer都弥散了，看不清楚，请问懂这方面的师兄师姐哪位能给指点一下，我的问题出在哪儿？已经有各因素的浓度梯度设置了，是不是只能从扩增程序的改变上先尝试解决弥散的问题，比如提高退火温度，减少循环数等？这两个措施我已经尝试过了，然后效果并不好，还是弥散。。。是不是模板的质量不好，也会有弥散的情况出现？哪位前辈做过这类实验的能给指点指点吧？实在不知道问题出在哪儿，也不知道该怎样改进，不知道该怎样向下进行下一步试验了。。。。。。谢谢各位了！！！！！！

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