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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR条带很暗，还有非特异性扩增，是什么问题
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swach

铁虫 (小有名气)

[求助] PCR条带很暗，还有非特异性扩增，是什么问题 已有4人参与

扩增nosZ基因，引物是 nosZ-F( 5'-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3') 和nosZ1622R( 5'-CGSACCTTSTTGCCSTYGCG-3')
扩增条件为95℃60s;95℃15s，53℃15s，72℃45s，循环40次。
体系为20微升，引物各1微升，模板分别为1和2微升。
电泳点样5微升，110V，30min。电泳图附件，条带很暗，是扩增条件不合适，还是引物不合理呢？谢谢大家

PCR条带很暗，还有非特异性扩增，是什么问题
nosz0.jpg
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1楼 2014-07-19 18:12:34
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:25:35
用touch down试一试
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踏实
2楼2014-07-19 22:05:55
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科研屌丝007

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:25:30
建议一：进行第二轮PCR，适当提高退火温度。建议二：感觉你目前的条带亮度还可以的，可以尝试切胶回收

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-07-20 00:23:20
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 科研屌丝007 at 2014-07-20 00:23:20
建议一：进行第二轮PCR，适当提高退火温度。建议二：感觉你目前的条带亮度还可以的，可以尝试切胶回收

这种亮度不行吧，在紫外下根本看不到，没办法切胶的。
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4楼2014-07-20 08:53:11
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hajierlove at 2014-07-19 22:05:55
用touch down试一试

是个touchdown了，效果还是不好。附图
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5楼2014-07-20 08:57:31
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1、提供的信息不明确、不具体：例如模板和引物用量1微升，读者无法判断引物浓度到底是多少，也不知道模板的量到底是多少。
2、就现有结果而言，是否有你的产物？换句话说，你的扩增产物是多大？图中几条带都是特异性产物？还是根本没有你要的？
3、你用的引物是degenerated primers。这种情况扩增起来有时比较复杂。从你现有的情况看，annealing温度不合适,可能太低。
4、建议：由于所用引物的特性，可以考虑开始时用较高退火温度，确保特异性，然后逐渐降低退火温度的方法。举例说：
第一循环：96C 20s, 65C 30s, 72C 30s;
第二循环：96C 20s， 62C 30s， 72C 35s；
第三循环：96C 20s，59C 30s， 72C 40s；然后：
四个循环：96C 20s，56C 30s， 72C 45s；  
五个循环： 96C 20s，53C 30s， 72C 50s；
二十五个循环： 94C 20s，50C 45s， 72C 60s； 最后：

通过上述措施，可以保证产物的特异性。只要扩增条件合适，产物的量自然就多了。
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6楼2014-07-20 10:37:58
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-20 10:37:58
1、提供的信息不明确、不具体：例如模板和引物用量1微升，读者无法判断引物浓度到底是多少，也不知道模板的量到底是多少。
2、就现有结果而言，是否有你的产物？换句话说，你的扩增产物是多大？图中几条带都是特异 ...

我们实验室暂时没有DNA测试仪，所以基因组的浓度没办法判断。根据师姐的经验配的体系。昨天又做了一次，有的是touchdown程序，每个循环降0.5度，结果还是有非特异性扩增。我知道自己的目的条带的大概位置。
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7楼2014-07-20 11:31:35
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader
引用回帖:
7楼: Originally posted by swach at 2014-07-19 22:31:35
我们实验室暂时没有DNA测试仪，所以基因组的浓度没办法判断。根据师姐的经验配的体系。昨天又做了一次，有的是touchdown程序，每个循环降0.5度，结果还是有非特异性扩增。我知道自己的目的条带的大概位置。...

降低annealing温度非特异性不是更严重了？我的建议看上去复杂了些，但只是program设定的问题，建议你试试。在你目前的温度下改变一度半度的不会有改善。
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8楼2014-07-20 11:35:58
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路人丙

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提高一点胶浓度试试，buf里稍微多加一些染料。
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9楼2014-07-20 12:30:11
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swach

铁虫 (小有名气)
我今天把退火温度提高，又做了一次，而且做了不同目的基因浓度梯度的，大家看看我能切胶回收做连接吗？marker后面的四个扩增的是amoA，后三个扩增的是nosZ。同学建议我切胶纯化做连接试试，条带是不是还是太暗了。
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10楼2014-07-20 18:00:25
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