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swach

铁虫 (小有名气)

[求助] PCR条带很暗，还有非特异性扩增，是什么问题 已有4人参与

扩增nosZ基因，引物是 nosZ-F( 5'-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3') 和nosZ1622R( 5'-CGSACCTTSTTGCCSTYGCG-3')
扩增条件为95℃60s;95℃15s，53℃15s，72℃45s，循环40次。
体系为20微升，引物各1微升，模板分别为1和2微升。
电泳点样5微升，110V，30min。电泳图附件，条带很暗，是扩增条件不合适，还是引物不合理呢？谢谢大家

PCR条带很暗，还有非特异性扩增，是什么问题
nosz0.jpg
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1楼 2014-07-19 18:12:34
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-07-20 10:37:58
1、提供的信息不明确、不具体：例如模板和引物用量1微升，读者无法判断引物浓度到底是多少，也不知道模板的量到底是多少。
2、就现有结果而言，是否有你的产物？换句话说，你的扩增产物是多大？图中几条带都是特异 ...

我们实验室暂时没有DNA测试仪，所以基因组的浓度没办法判断。根据师姐的经验配的体系。昨天又做了一次，有的是touchdown程序，每个循环降0.5度，结果还是有非特异性扩增。我知道自己的目的条带的大概位置。
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7楼2014-07-20 11:31:35
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:25:35
用touch down试一试
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踏实
2楼2014-07-19 22:05:55
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科研屌丝007

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-20 21:25:30
建议一：进行第二轮PCR，适当提高退火温度。建议二：感觉你目前的条带亮度还可以的，可以尝试切胶回收

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-07-20 00:23:20
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swach

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 科研屌丝007 at 2014-07-20 00:23:20
建议一：进行第二轮PCR，适当提高退火温度。建议二：感觉你目前的条带亮度还可以的，可以尝试切胶回收

这种亮度不行吧，在紫外下根本看不到，没办法切胶的。
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4楼2014-07-20 08:53:11
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