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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌落PCR出现非特异性扩增，测序峰图出现套峰
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怀西扬

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌落PCR出现非特异性扩增，测序峰图出现套峰


如上图所示，菌落PCR出现非特异性扩增，其中目的条带很亮，约750bp；下面的非特异性条带大约600-700bp。
外送测序失败，说是从一开始就出现套峰，如下图所示：


请问是什么原因造成的呢？具体的解决办法？谢谢！！！
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1楼 2012-06-07 18:12:56
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suifeng91

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-09 13:41:27
怀西扬: 金币+1 2012-06-11 16:48:28
可能是最初PCR模板有多个引物结合区域，建议如下：
充分电泳后，回收目的条带，重新连接T载体，PCR再次鉴定，基本上可以消除非特异性扩增条带。
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人生不是一场物质的盛宴，而是一次灵魂的修炼，使它在谢幕之时比开幕之初更为高尚。
2楼2012-06-08 15:07:39
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Renavatio

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
怀西扬: 金币+2, ★有帮助 2012-06-11 16:48:13
PCR条件不合适，退火温度过低，导致引物于模版非特异性结合，不知道你有没有做过单引物对照
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Undefined！
3楼2012-06-09 10:41:02
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yuzhiming

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-09 13:41:37
怀西扬: 金币+2, ★有帮助 2012-06-11 16:48:21
1.  重新划线挑取单克隆。
2.  采用载体上的通用引物，如果是自己设计的引物，请确保引物的特异性。
3. 鉴定最好不要用菌液PCR，如果可能，可以采用提取质粒，做PCR或者酶切检测。

祝顺利。
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4楼2012-06-09 11:17:33
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jqq1985

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
怀西扬: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-06-11 16:47:49
套峰说明样品里面有空载体的污染，或者里的载体有两个可以和测序引物结合的位点。
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5楼2012-06-10 14:42:35
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flownaway

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

出现了空载体污染，试着纯化一下
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6楼2012-06-10 20:42:26
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