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swach

铁虫 (小有名气)

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[求助] PCR条带很暗，还有非特异性扩增，是什么问题已有4人参与

扩增nosZ基因，引物是 nosZ-F( 5'-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3') 和nosZ1622R( 5'-CGSACCTTSTTGCCSTYGCG-3')
扩增条件为95℃60s;95℃15s，53℃15s，72℃45s，循环40次。
体系为20微升，引物各1微升，模板分别为1和2微升。
电泳点样5微升，110V，30min。电泳图附件，条带很暗，是扩增条件不合适，还是引物不合理呢？谢谢大家

nosz0.jpg

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1楼 2014-07-19 18:12:34

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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

Translator and Proofreader

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

1、提供的信息不明确、不具体：例如模板和引物用量1微升，读者无法判断引物浓度到底是多少，也不知道模板的量到底是多少。
2、就现有结果而言，是否有你的产物？换句话说，你的扩增产物是多大？图中几条带都是特异性产物？还是根本没有你要的？
3、你用的引物是degenerated primers。这种情况扩增起来有时比较复杂。从你现有的情况看，annealing温度不合适,可能太低。
4、建议：由于所用引物的特性，可以考虑开始时用较高退火温度，确保特异性，然后逐渐降低退火温度的方法。举例说：
第一循环：96C 20s, 65C 30s, 72C 30s;
第二循环：96C 20s， 62C 30s， 72C 35s；
第三循环：96C 20s，59C 30s， 72C 40s；然后：
四个循环：96C 20s，56C 30s， 72C 45s；
五个循环： 96C 20s，53C 30s， 72C 50s；
二十五个循环： 94C 20s，50C 45s， 72C 60s；最后：

通过上述措施，可以保证产物的特异性。只要扩增条件合适，产物的量自然就多了。