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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RNA提取及电泳
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霍烨zz

银虫 (小有名气)

[求助] RNA提取及电泳已有1人参与

提取的肠道粘膜RNA，测了OD值，结果如下：
RNA提取及电泳

还想检测下完整性，所以跑了电泳
用的是1%琼脂糖+2ul golden view
5ul RNA + 5ul 2X RNA loading dye (65℃，变性10min）
然后110V，跑了30min，结果却是这么个样子：（上样量8ul）

RNA提取及电泳-1

不知道是出了什么问题呢？

另，因为是要做转录组测试，所以公司对样品要求比较严格，说是跑胶必须是28S和18S两条带的比例接近2
但我有个疑问，就是转录组测序主要是针对mRNA，而mRNA在total RNA中只占1~5%，几乎都不能在胶上看到，那么电泳胶没跑好就一定意味着做不了测序吗？
像我这种情况送样给公司，能有多大把握成功测序？
谢谢大家了！！
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1楼2014-11-19 22:48:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

哈斗

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-11-21 23:22:06
通过28S和18S两条带的比例接近2来判断RNA有无降解，是方法之一。送样到公司后，他们会对RNA做质检的，我们送的公司，出具了安捷伦2100质检报告给我们，以RIN值来判断。跑琼脂糖电泳，影响因素比较多，有可能是电泳过程中引起的降解。还有你送样的是RNA，万一运输路上降解算谁的？不如直接让公司抽提更保险。
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霍烨zz
2楼2014-11-20 09:27:14
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霍烨zz

银虫 (小有名气)
霍烨zz: 回帖置顶 2014-11-24 10:55:30
第二次提RNA和跑胶，求大家再帮忙看看
Nanodrop结果：
RNA提取及电泳-2

RNA电泳图：
RNA提取及电泳-3

感觉有几个泳道的结果还是可以，但是不明白为什么最后的5S条带居然还那么明显？不是说最好看不到吗？

而且一起做的，除了最后一个泳道点样的时候出了问题，不知道其他几个是因为什么原因没跑出来......
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13楼2014-11-24 10:55:27
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普通回帖

leopard2011

新虫 (初入文坛)
RNA要稀释的，不稀释用原液跑胶就是这样，你稀释30-100倍看看
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霍烨zz
3楼2014-11-20 09:45:01
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
霍烨zz: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-11-20 10:15:14
RNA应该还是不错的，只是你点的太多，胶也做得不怎么好，所以图不好

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2014-11-20 09:50:48
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霍烨zz

银虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by 哈斗 at 2014-11-20 09:27:14
通过28S和18S两条带的比例接近2来判断RNA有无降解，是方法之一。送样到公司后，他们会对RNA做质检的，我们送的公司，出具了安捷伦2100质检报告给我们，以RIN值来判断。跑琼脂糖电泳，影响因素比较多，有可能是电泳过 ...

谢谢！
我想的是胶跑出来之后再送，做后面检测通过的概率会更大些。
之前送了两批样给一家公司抽提，RNA都不合格，所以才决定自己验证一下；不过也在考虑换一家公司了！
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5楼2014-11-20 10:19:14
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霍烨zz

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by leopard2011 at 2014-11-20 09:45:01
RNA要稀释的，不稀释用原液跑胶就是这样，你稀释30-100倍看看

谢谢！
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6楼2014-11-20 10:19:56
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霍烨zz

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-11-20 09:50:48
RNA应该还是不错的，只是你点的太多，胶也做得不怎么好，所以图不好

做胶有些什么技巧和需要格外注意的地方吗？
确实做胶时废了两块，一块是太硬了，不一会儿梳子都不好拔；一块是凝得太快了，倒胶时都不怎么流动了......
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7楼2014-11-20 10:23:12
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-20 11:13:57
霍烨zz: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-11-20 11:39:22
做胶的时候是有技巧的，比如你要配1%的胶，原则上你要0.2g琼脂糖加20ml TAE,但为了防止蒸发，你要加25ml的TAE，还有就是微波炉加热过程中间，可以拿出来摇匀一下，再放入微波炉，煮沸后，立即在水龙头下冲一下，迅速降温，但切忌不能在冰上冷却，不然会爆的，如果你的手可以承受这个温度，就立马倒胶，注意这两点就可以了，重点就是快
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医学&统计学
8楼2014-11-20 11:05:23
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yvanzeng

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
霍烨zz(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:20:37
加入RNA的量过多呢，我一般都是用1ugRNA去跑就可以，1%的胶120V跑20min就可以。
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9楼2014-11-21 08:32:46
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会翻身的蜗牛

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
RNA的量过多了吧
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加油加油
10楼2014-11-21 09:01:39
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