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霍烨zz

银虫 (小有名气)

[求助] RNA提取及电泳已有1人参与

提取的肠道粘膜RNA,测了OD值,结果如下:
RNA提取及电泳

还想检测下完整性,所以跑了电泳
用的是1%琼脂糖+2ul golden view
5ul RNA + 5ul 2X RNA loading dye (65℃,变性10min)
然后110V,跑了30min,结果却是这么个样子:(上样量8ul)

RNA提取及电泳-1

不知道是出了什么问题呢?

另,因为是要做转录组测试,所以公司对样品要求比较严格,说是跑胶必须是28S和18S两条带的比例接近2
但我有个疑问,就是转录组测序主要是针对mRNA,而mRNA在total RNA中只占1~5%,几乎都不能在胶上看到,那么电泳胶没跑好就一定意味着做不了测序吗?
像我这种情况送样给公司,能有多大把握成功测序?
谢谢大家了!!
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霍烨zz

银虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 哈斗 at 2014-11-20 09:27:14
通过28S和18S两条带的比例接近2来判断RNA有无降解,是方法之一。送样到公司后,他们会对RNA做质检的,我们送的公司,出具了安捷伦2100质检报告给我们,以RIN值来判断。跑琼脂糖电泳,影响因素比较多,有可能是电泳过 ...

谢谢!
我想的是胶跑出来之后再送,做后面检测通过的概率会更大些。
之前送了两批样给一家公司抽提,RNA都不合格,所以才决定自己验证一下;不过也在考虑换一家公司了!
5楼2014-11-20 10:19:14
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霍烨zz

银虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by leopard2011 at 2014-11-20 09:45:01
RNA要稀释的,不稀释用原液跑胶就是这样,你稀释30-100倍看看

谢谢!
6楼2014-11-20 10:19:56
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霍烨zz

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-11-20 09:50:48
RNA应该还是不错的,只是你点的太多,胶也做得不怎么好,所以图不好

做胶有些什么技巧和需要格外注意的地方吗?
确实做胶时废了两块,一块是太硬了,不一会儿梳子都不好拔;一块是凝得太快了,倒胶时都不怎么流动了......
7楼2014-11-20 10:23:12
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霍烨zz

银虫 (小有名气)

霍烨zz: 回帖置顶 2014-11-24 10:55:30
第二次提RNA和跑胶,求大家再帮忙看看
Nanodrop结果:
RNA提取及电泳-2

RNA电泳图:
RNA提取及电泳-3

感觉有几个泳道的结果还是可以,但是不明白为什么最后的5S条带居然还那么明显?不是说最好看不到吗?

而且一起做的,除了最后一个泳道点样的时候出了问题,不知道其他几个是因为什么原因没跑出来......
13楼2014-11-24 10:55:27
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