| 查看: 3493 | 回复: 15 | ||||||
| 本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||||
lmcyjxs金虫 (正式写手)
|
[交流]
RNA提取及电泳问题（附图），虫友们能否帮我分析下啊~~已有3人参与
|
|||||
虽然我实在不敢拿出来见人了，但极其希望大家能一起帮我看看，我这边实验室很少能找到类似方向的人讨论交流啊~~~~~o(>_< o ~~如图，第一，虽然能跑出条带来，看似也没有降解，但跑的电泳图出现花白的一片，不知道是不是胶制的不好（我在制胶时，胶跟托板粘得不牢，有移动过，TAE放了1个月左右），或是有蛋白杂质污染。 另外就是我跑的电泳图（此时的TAE是新配的了）出现一条弯曲的条带（看第二个图），在暗处就能看到。连DNA marker 也没跑出来，不知道是什么问题。 我用异硫氰酸胍-SDS法提取植物茎RNA，所用的试剂全是自己配的； 至于去蛋白那一步，我用水饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）去了一次，再用氯仿去1次，一般用水饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）去了一次后，再用氯仿去（此步我没有用力震荡，只是稍微振荡再涡旋10来秒），肉眼看两相分层处几乎没有白色蛋白了。 另外我提取的RNA保存-80℃的75%酒精中，这样会有问题吗？关于RNA的保存网上有很很多说法，搞得我不知道该怎么做，虽然可以反转录成cDNA ,但是我引物还没弄好，可以先反转录成cDNA，扩增那块春节后再做吗？如果反转录成cDNA，可以用什么办法检测一下cDNA的质量吗？虫友们能否介绍下保存RNA的方法？ 注： 我的电泳缓冲液是自配的1XTAE液（直接按比例配成20mL的50XTAE液，再稀释成1XTAE液的） 10X10cm规格的胶，电流电压100mA、100V 采用点染法，1%左右的琼脂糖胶，DNAmarker 我稀释了40倍，取5uL与2uL稀释100倍的sybr Green I 混匀，及加1ul的6Xloding buffer上样液跑的。也不知道这样操作有没有问题。 我都想崩溃了，我也不知道哪里出了问题~~望各位虫友多指教啊~~  1.jpg  2.jpg |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | 【分子生物】EPI帖 | 细胞培养 |
» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有186人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
RNA 提取后，电泳显示全部为5s处弥散片段，求帮助
已经有21人回复- 想咨询一下大家，RNA电泳图的相关问题~~~~谢谢
已经有7人回复
- 想咨询一下关于RNA电泳的问题。谢谢！
已经有5人回复
- 请好心虫友帮我分析一下RNA电泳图
已经有16人回复
- 提取RNA后跑电泳，条带非常不清晰怎么回事啊？我是新手，谢谢啦！
已经有6人回复
- 植物RNA提取电泳图，求解析！
已经有3人回复
- trizol法手提虾肠道RNA电泳图，求分析
已经有12人回复
- 植物RNA提取后电泳检测
已经有16人回复
- 提取的rna浓度只有60ng/ul，影响逆转录吗，请好心虫友指点
已经有17人回复
- 提取RNA电泳上样量
已经有21人回复
- rt-pcr电泳图，求好心虫友帮助分析一下，跪谢。。。
已经有14人回复
- 虫友们，有谁用过杭州宝赛生物公司的rna提取试剂盒啊，效果怎么样啊？
已经有6人回复
- 请好心虫友帮我分析一下rna电泳图，谢谢啦。。。
已经有18人回复
- 昆虫RNA 提取！电泳图，看不懂！请高手指点！
已经有9人回复
- 柞蚕总RNA提取中，蛋白抽提不尽
已经有12人回复
- 分子生物版之电泳专题-重金奖励
已经有67人回复
- 求高手指点RNA电泳图~~~~
已经有25人回复
- 请请各位帮忙分析一下我的RNA电泳图
已经有6人回复
- 请帮忙分析一下RNA电泳图
已经有8人回复
- RNA电泳条带滞后？
已经有5人回复
- 【求助/交流】帮我看看假丝酵母总RNA提取电泳图
已经有7人回复
- 重新传照片,帮忙分析RNA电泳图有赏
已经有8人回复
- 【求助/交流】帮我分析一下RNA电泳图
已经有20人回复
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 回帖置顶 2013-01-20 18:16:05
amisking: 金币+4, MolEPI+1, 感谢应助！ 2013-01-20 18:16:16
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 回帖置顶 2013-01-20 18:16:05
amisking: 金币+4, MolEPI+1, 感谢应助！ 2013-01-20 18:16:16
|
没有见过你的胶的情况。DNA marker稀释40倍是不是倍数多了些？加染料一般要放置几分钟让染料与DNA充分结合。 至于胶从托板滑脱的话，一般就是放回去就可以了。托板只是起到电泳时固定胶的作用。 你可以把RNA先反转录成cDNA保存。cDNA比RNA稳定性要好一些。注意把DNA消化好再做反转录。反转录后的cDNA质量是无法检测的。因为反应体系里既有合成出的cDNA也有RNA。而且合成出来的cDNA丰度和分子量不均一。虽然说可以把RNA消化掉，但是一般大家都不这样去做。因为RNA是不影响下面的PCR定量的。 |
2楼2013-01-20 10:39:17
lmcyjxs
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1088.2
- 散金: 119
- 红花: 7
- 帖子: 954
- 在线: 124.3小时
- 虫号: 1255578
- 注册: 2011-04-05
- 性别: MM
- 专业: 中药资源
|
你好！我知道我的电泳图为什么是这样的了，我来解释一下，同时也希望可以对一些像我这样的新手避免发生这样的问题： 第一张电泳图RNA提取的很好，但是拍照的时候漏光了，胶在白光下泛白，当我关了灯后，图像会很清晰。 第二张电泳图是胶没配好，太干了或还没干时拔梳子时，使胶在梳子边缘不同程度的损伤，以前不知道该凝多久没一个度，同学之间的说法并没到重点，其实胶凝不能太干，但半个小时还是应该的，半个 小时后看胶的表面，如果自己能看到水分缺失的样子，那么肯定太干了，肯定会容易损伤凝胶。 marker 不清晰，第一上样量是否够（之前没买过marker，后来才知道marker一般不用稀释了，使用说明看说明书就好），第二核酸染料是否够或没有问题，第三电泳液是否缓冲能力差了，第四上样时是否损伤了凝胶或漂浮，第五：胶浓度不均匀（此时容易跑歪） 另外，RNA我是100v 100mA跑15min，虽然我知道DNA Marker跑不开，但证明我的胶没事，染色清晰就好了。 |
15楼2013-04-06 09:48:39
lmcyjxs
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1088.2
- 散金: 119
- 红花: 7
- 帖子: 954
- 在线: 124.3小时
- 虫号: 1255578
- 注册: 2011-04-05
- 性别: MM
- 专业: 中药资源
3楼2013-01-20 12:13:01
lmcyjxs
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1088.2
- 散金: 119
- 红花: 7
- 帖子: 954
- 在线: 124.3小时
- 虫号: 1255578
- 注册: 2011-04-05
- 性别: MM
- 专业: 中药资源
4楼2013-01-20 12:14:29
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
5楼2013-01-20 12:45:29
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
6楼2013-01-20 12:46:42
lmcyjxs
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1088.2
- 散金: 119
- 红花: 7
- 帖子: 954
- 在线: 124.3小时
- 虫号: 1255578
- 注册: 2011-04-05
- 性别: MM
- 专业: 中药资源
7楼2013-01-20 15:27:46
8楼2013-01-20 19:03:45
lmcyjxs
金虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 17 (小学生)
- 金币: 1088.2
- 散金: 119
- 红花: 7
- 帖子: 954
- 在线: 124.3小时
- 虫号: 1255578
- 注册: 2011-04-05
- 性别: MM
- 专业: 中药资源
9楼2013-01-20 19:28:00
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
10楼2013-01-21 05:08:49