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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA提取及电泳问题（附图），虫友们能否帮我分析下啊~~
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

[交流] RNA提取及电泳问题（附图），虫友们能否帮我分析下啊~~已有3人参与

虽然我实在不敢拿出来见人了，但极其希望大家能一起帮我看看，我这边实验室很少能找到类似方向的人讨论交流啊~~~~~o(>_<o ~~

如图，第一，虽然能跑出条带来，看似也没有降解，但跑的电泳图出现花白的一片，不知道是不是胶制的不好（我在制胶时，胶跟托板粘得不牢，有移动过，TAE放了1个月左右），或是有蛋白杂质污染。
另外就是我跑的电泳图（此时的TAE是新配的了）出现一条弯曲的条带（看第二个图），在暗处就能看到。连DNA marker 也没跑出来，不知道是什么问题。

我用异硫氰酸胍-SDS法提取植物茎RNA，所用的试剂全是自己配的；

至于去蛋白那一步，我用水饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）去了一次，再用氯仿去1次，一般用水饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）去了一次后，再用氯仿去（此步我没有用力震荡，只是稍微振荡再涡旋10来秒），肉眼看两相分层处几乎没有白色蛋白了。

另外我提取的RNA保存-80℃的75%酒精中，这样会有问题吗？关于RNA的保存网上有很很多说法，搞得我不知道该怎么做，虽然可以反转录成cDNA ,但是我引物还没弄好，可以先反转录成cDNA，扩增那块春节后再做吗？如果反转录成cDNA，可以用什么办法检测一下cDNA的质量吗？虫友们能否介绍下保存RNA的方法？

注：
我的电泳缓冲液是自配的1XTAE液（直接按比例配成20mL的50XTAE液，再稀释成1XTAE液的）
10X10cm规格的胶，电流电压100mA、100V
采用点染法，1%左右的琼脂糖胶，DNAmarker 我稀释了40倍，取5uL与2uL稀释100倍的sybr Green I
混匀，及加1ul的6Xloding buffer上样液跑的。也不知道这样操作有没有问题。

我都想崩溃了，我也不知道哪里出了问题~~望各位虫友多指教啊~~

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思路决定出路。。。
1楼2013-01-20 09:58:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-01-20 12:14:29
还有就是一般DNAmarker 稀释几倍来上样啊？我第一次用DNA marker，也没有经验，多多请教啊~~...

marker用量按照产品说明就可以了。因为你的胶上marker没有出来，所以我问一下。
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6楼2013-01-20 12:46:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 回帖置顶 2013-01-20 18:16:05
amisking: 金币+4, MolEPI+1, 感谢应助！ 2013-01-20 18:16:16
没有见过你的胶的情况。DNA marker稀释40倍是不是倍数多了些？加染料一般要放置几分钟让染料与DNA充分结合。
至于胶从托板滑脱的话，一般就是放回去就可以了。托板只是起到电泳时固定胶的作用。
你可以把RNA先反转录成cDNA保存。cDNA比RNA稳定性要好一些。注意把DNA消化好再做反转录。反转录后的cDNA质量是无法检测的。因为反应体系里既有合成出的cDNA也有RNA。而且合成出来的cDNA丰度和分子量不均一。虽然说可以把RNA消化掉，但是一般大家都不这样去做。因为RNA是不影响下面的PCR定量的。
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2楼2013-01-20 10:39:17
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-20 10:39:17
没有见过你的胶的情况。DNA marker稀释40倍是不是倍数多了些？加染料一般要放置几分钟让染料与DNA充分结合。
至于胶从托板滑脱的话，一般就是放回去就可以了。托板只是起到电泳时固定胶的作用。
你可以把RNA先反转 ...

谢谢，那消化DNA一般是买DNA消化酶吗？
还有我怀疑自己的是蛋白质或有机物污染太严重，可不可以把RNA沉淀溶解了再重复去蛋白步骤？
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思路决定出路。。。
3楼2013-01-20 12:13:01
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-20 10:39:17
没有见过你的胶的情况。DNA marker稀释40倍是不是倍数多了些？加染料一般要放置几分钟让染料与DNA充分结合。
至于胶从托板滑脱的话，一般就是放回去就可以了。托板只是起到电泳时固定胶的作用。
你可以把RNA先反转 ...

还有就是一般DNAmarker 稀释几倍来上样啊？我第一次用DNA marker，也没有经验，多多请教啊~~
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思路决定出路。。。
4楼2013-01-20 12:14:29
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