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weining1203新虫 (小有名气)
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[求助]
提取的rna浓度只有60ng/ul，影响逆转录吗，请好心虫友指点
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孙启亮
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 应助指数+1, 专家考核, 辛苦 2012-04-27 13:55:47
西瓜: 金币+3, MolEPI+1, 专家考核, Good！还是要努力提高一下RNA浓度。 2012-04-29 09:23:15
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西瓜: 金币+3, MolEPI+1, 专家考核, Good！还是要努力提高一下RNA浓度。 2012-04-29 09:23:15
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影响，因为你提的RNA无论是否是使用试剂盒，里面都会有有机溶剂什么的，这些有机溶剂都可能是逆转录的抑制剂，你这么低的浓度是不能用于逆转录的。 楼主逆转录之后要PCR吧，试剂盒上可能会说浓度像你这么低就可以用。但他们想表达的不是这个意思，PCR是很敏感的，这么低的浓度确实能检测出来，但前提是在没有抑制剂的情况下。他们所说的RNA浓度，是指提取之后浓度很高然后稀释到100ng，你这个原始浓度都没有达到很高，体系里面存在的逆转录试剂是PCR的抑制剂，所以是不能用的。 国内有很多人做胚胎干细胞，他们的细胞个数只有32，用专用的试剂盒提取到的RNA浓度虽然很低，但是他们的RNA就可以用于PCR，如果你的是普通的细胞，这么低的浓度是不能使用的。 |
3楼2012-04-27 10:12:28
holyala
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2楼2012-04-27 10:03:33
holyala
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-27 13:56:21
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-27 13:56:21
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不知道你是否亲手做过RNA提取和反转录等实验，我用过的QIAGEN、TIANGEN的试剂盒提RNA，也用过TRIzol法，还真没遇到过因为有机溶剂残留而影响后续实验的。目前提取RNA的试剂盒大多数用的是异硫氰酸胍裂解结合硅胶柱吸附法，几乎用不到什么有机溶剂。至于TRIzol法，由于要用酚氯仿抽提除蛋白，氯仿确实有可能残留，不过这种可能性...因为水相和有机相分离明显，因此只要操作得当，几乎可以忽略。最后就是沉淀RNA的时候会用到乙醇或异丙醇，这俩玩意儿确实会严重抑制下游实验中酶的活性，但也是可以通过严格遵守操作标准来进行实验而避免的。 最后，我得说，RT-PCR是敏感度非常高的实验操作，因此基因组DNA的污染影响远远大于RNA总量不足的问题，楼主要根据自己的实验目的来判断这些RNA是否可用。 |
6楼2012-04-27 13:32:07
weining1203
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4楼2012-04-27 10:25:44
holyala
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 专家考核, W5 2012-04-28 09:29:48
小丹木木: 金币+3, 专家考核, W5 2012-04-28 09:29:48
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我说的有机溶剂主要指乙醇，不知你有没有注意到这种情况，当你对RNA跑胶的时候，假设样品5微升，用6X的loadingbuffer理论上只有1微升就够了，但在实际操作的时候，即使你加2微升，那样品仍然会漂浮不沉淀。我们分析有可能就是因为有机溶剂的水溶性的影响。不知你对此是否有过注意。至于其他的残留你所说都是“几乎可以忽略”“可以避免”，前提也都是严格操作，那么以楼主的角度来看，提出的RNA浓度如此之低到底是因为自己操作的问题还是自己样品自身的问题呢？如果是自身操作的问题，那么上述所提到的问题能“几乎可以忽略”“可以避免”吗？如果是样品本身的问题，那这些问题自然不必要拘泥，巧妇难为无米之炊嘛。我也有举例，如果你做胚胎实验，细胞量这么少，你怎么能够保证高浓度RNA呢？ 另外，如果反转录之后是做PCR，试问下低浓度的RNA是否会影响目的片段的拷贝数？如果目的片段的拷贝数太低那么引物发生非特异性结合的概率就高了，我认为对目的片段的扩增还是有影响的。 我做的一个基因就是低拷贝，实验却恰恰要对进行定量，很纠结。个人认为与其论证这么低的RNA浓度能否影响后续，倒不如想法设法去提高他。 |
7楼2012-04-27 13:59:17
孙启亮
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9楼2012-04-27 14:07:26
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