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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取的rna浓度只有60ng/ul，影响逆转录吗，请好心虫友指点
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 专家考核 2012-04-28 08:30:12
引用回帖:
10楼: Originally posted by holyala at 2012-04-27 14:17:14:
嗯嗯~~~再讨论一下，你提到关于+6X loading buffer跑胶的问题...这个我还真没遇到过。你得出的结论是有机溶剂的水溶性影响。然而前面你又提到有机溶剂主要指乙醇...但乙醇和水完全是互溶的，如何产生影响？如果有 ...

我的理解是乙醇溶于水，可能对样品产生影响，导致样品在点样孔中发漂，我们的解决方法是多加loading buffer，加倍
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11楼2012-04-27 14:52:47
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weining1203

新虫 (小有名气)
谢谢大家的回复，我只是想逆转录后克隆一个基因，这个rna浓度低吗？
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12楼2012-04-27 17:02:33
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by holyala at 2012-04-27 13:16:14:
这个我觉得要看你的实验目的是什么，如果只是做个反转录，再PCR扩某个特定基因出来，这是完全够了的。如果要做全转录组测序或者表达量分析，那肯定不够。举个例子吧，我做细菌全转录组测序，也只需要5~10ug总RNA。

谢谢回复，我就是反转录后克隆一个基因。。。
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13楼2012-04-27 17:04:24
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by holyala at 2012-04-27 14:07:26:
前面大段多为主观题，这就不讨论了。
后两点我均表示认同。RNA总量过低绝对会影响表达量或拷贝数的分析，如果通过改进实验方法或操作可以提高RNA产率，我也非常建议这么做。因此我也提到楼主需要根据自己的实验 ...

谢谢回复，我就是要反转录然后扩一个基因，这个浓度没问题吧？
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14楼2012-04-27 17:05:33
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分子菜鸟

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-28 09:31:04
得看干什么用了。如果只是做个PCR的模板，质量够好的话这点浓度足够了。最好先跑个电泳看看质量，质量好就可以用。
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15楼2012-04-28 09:04:30
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 分子菜鸟 at 2012-04-28 09:04:30:
得看干什么用了。如果只是做个PCR的模板，质量够好的话这点浓度足够了。最好先跑个电泳看看质量，质量好就可以用。

就是做pcr，克隆一个基因
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16楼2012-04-28 10:18:33
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-29 17:06:35
引用回帖:
14楼: Originally posted by weining1203 at 2012-04-27 17:05:33:
谢谢回复，我就是要反转录然后扩一个基因，这个浓度没问题吧？

我认为没有问题，RT-PCR非常敏感，理想状态下单拷贝的片段也能获得扩增，所以你这个1.2ug的总RNA是够的。当然，我也同意“孙启亮”虫友的观点，如果能提高RNA的量，当然是最好的。因为写文章时，样本的质量对重复性和可靠性是有很大影响的，能不让别人argue那就最好了，不是吗？
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17楼2012-04-28 10:57:03
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by holyala at 2012-04-28 10:57:03:
我认为没有问题，RT-PCR非常敏感，理想状态下单拷贝的片段也能获得扩增，所以你这个1.2ug的总RNA是够的。当然，我也同意“孙启亮”虫友的观点，如果能提高RNA的量，当然是最好的。因为写文章时，样本的质量对重复 ...

是的  呵呵  谢谢回复。。。  提的rna有dna污染 需要消化一下，消化后rna浓度就变低了。。。  没有消化前rna浓度还是非常高的，跑的带比marker还要亮。。。但消化后就浓度低了。。。
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18楼2012-04-28 21:22:11
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