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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


小丹木木: 金币+1, 专家考核 2012-04-28 08:30:12
引用回帖:
10楼: Originally posted by holyala at 2012-04-27 14:17:14:
嗯嗯~~~再讨论一下,你提到关于+6X loading buffer跑胶的问题...这个我还真没遇到过。你得出的结论是有机溶剂的水溶性影响。然而前面你又提到有机溶剂主要指乙醇...但乙醇和水完全是互溶的,如何产生影响?如果有 ...

我的理解是乙醇溶于水,可能对样品产生影响,导致样品在点样孔中发漂,我们的解决方法是多加loading buffer,加倍
11楼2012-04-27 14:52:47
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weining1203

新虫 (小有名气)

谢谢大家的回复,我只是想逆转录后克隆一个基因,这个rna浓度低吗?
12楼2012-04-27 17:02:33
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weining1203

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by holyala at 2012-04-27 13:16:14:
这个我觉得要看你的实验目的是什么,如果只是做个反转录,再PCR扩某个特定基因出来,这是完全够了的。如果要做全转录组测序或者表达量分析,那肯定不够。举个例子吧,我做细菌全转录组测序,也只需要5~10ug总RNA。

谢谢回复,我就是反转录后克隆一个基因。。。
13楼2012-04-27 17:04:24
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weining1203

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by holyala at 2012-04-27 14:07:26:
前面大段多为主观题,这就不讨论了。
后两点我均表示认同。RNA总量过低绝对会影响表达量或拷贝数的分析,如果通过改进实验方法或操作可以提高RNA产率,我也非常建议这么做。因此我也提到楼主需要根据自己的实验 ...

谢谢回复,我就是要反转录然后扩一个基因,这个浓度没问题吧?
14楼2012-04-27 17:05:33
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分子菜鸟

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-28 09:31:04
得看干什么用了。如果只是做个PCR的模板,质量够好的话这点浓度足够了。最好先跑个电泳看看质量,质量好就可以用。
15楼2012-04-28 09:04:30
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weining1203

新虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 分子菜鸟 at 2012-04-28 09:04:30:
得看干什么用了。如果只是做个PCR的模板,质量够好的话这点浓度足够了。最好先跑个电泳看看质量,质量好就可以用。

就是做pcr,克隆一个基因
16楼2012-04-28 10:18:33
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-29 17:06:35
引用回帖:
14楼: Originally posted by weining1203 at 2012-04-27 17:05:33:
谢谢回复,我就是要反转录然后扩一个基因,这个浓度没问题吧?

我认为没有问题,RT-PCR非常敏感,理想状态下单拷贝的片段也能获得扩增,所以你这个1.2ug的总RNA是够的。当然,我也同意“孙启亮”虫友的观点,如果能提高RNA的量,当然是最好的。因为写文章时,样本的质量对重复性和可靠性是有很大影响的,能不让别人argue那就最好了,不是吗?
17楼2012-04-28 10:57:03
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weining1203

新虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by holyala at 2012-04-28 10:57:03:
我认为没有问题,RT-PCR非常敏感,理想状态下单拷贝的片段也能获得扩增,所以你这个1.2ug的总RNA是够的。当然,我也同意“孙启亮”虫友的观点,如果能提高RNA的量,当然是最好的。因为写文章时,样本的质量对重复 ...

是的  呵呵  谢谢回复。。。  提的rna有dna污染 需要消化一下,消化后rna浓度就变低了。。。  没有消化前rna浓度还是非常高的,跑的带比marker还要亮。。。但消化后就浓度低了。。。
18楼2012-04-28 21:22:11
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