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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取的rna浓度只有60ng/ul，影响逆转录吗，请好心虫友指点
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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] 提取的rna浓度只有60ng/ul，影响逆转录吗，请好心虫友指点

问题如标题，请好心的虫友指点一下。
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1楼2012-04-27 09:19:07
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-27 13:55:08
60ng/uL，你应该不止1uL吧？通常逆转录只需要~100ng就很够了，所以你RNA的浓度没问题。关键是RNA完整性如何，是否有基因组DNA污染，这才是影响逆转录及后续实验的关键。
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2楼2012-04-27 10:03:33
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-27 13:56:06
weining1203: 金币+2, ★★★很有帮助, 谢谢您的指点 2012-04-29 08:16:52
引用回帖:
4楼: Originally posted by weining1203 at 2012-04-27 10:25:44:
谢谢您的回复，您说地100ng是总rna的量还是mRNA的量啊，逆转录试剂盒要求mRNA的量为50-500ng，我最多加总rna20ul，算起来一共1200ng，但mrna一般只占总rna的1%左右吧，才12ng，是不是太少了。。。

这个我觉得要看你的实验目的是什么，如果只是做个反转录，再PCR扩某个特定基因出来，这是完全够了的。如果要做全转录组测序或者表达量分析，那肯定不够。举个例子吧，我做细菌全转录组测序，也只需要5~10ug总RNA。
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5楼2012-04-27 13:16:14
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-27 13:56:21
引用回帖:
3楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-27 10:12:28:
影响，因为你提的RNA无论是否是使用试剂盒，里面都会有有机溶剂什么的，这些有机溶剂都可能是逆转录的抑制剂，你这么低的浓度是不能用于逆转录的。
楼主逆转录之后要PCR吧，试剂盒上可能会说浓度像你这么低就可以 ...

不知道你是否亲手做过RNA提取和反转录等实验，我用过的QIAGEN、TIANGEN的试剂盒提RNA，也用过TRIzol法，还真没遇到过因为有机溶剂残留而影响后续实验的。目前提取RNA的试剂盒大多数用的是异硫氰酸胍裂解结合硅胶柱吸附法，几乎用不到什么有机溶剂。至于TRIzol法，由于要用酚氯仿抽提除蛋白，氯仿确实有可能残留，不过这种可能性...因为水相和有机相分离明显，因此只要操作得当，几乎可以忽略。最后就是沉淀RNA的时候会用到乙醇或异丙醇，这俩玩意儿确实会严重抑制下游实验中酶的活性，但也是可以通过严格遵守操作标准来进行实验而避免的。
最后，我得说，RT-PCR是敏感度非常高的实验操作，因此基因组DNA的污染影响远远大于RNA总量不足的问题，楼主要根据自己的实验目的来判断这些RNA是否可用。
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6楼2012-04-27 13:32:07
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
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7楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-27 13:59:17:
我说的有机溶剂主要指乙醇，不知你有没有注意到这种情况，当你对RNA跑胶的时候，假设样品5微升，用6X的loadingbuffer理论上只有1微升就够了，但在实际操作的时候，即使你加2微升，那样品仍然会漂浮不沉淀。我们分 ...

前面大段多为主观题，这就不讨论了。
后两点我均表示认同。RNA总量过低绝对会影响表达量或拷贝数的分析，如果通过改进实验方法或操作可以提高RNA产率，我也非常建议这么做。因此我也提到楼主需要根据自己的实验目的来判断RNA是否可用。如果LZ只是要反转录再扩个基因出来做载体连接+转化或者测序呢？
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9楼2012-04-27 14:07:26
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
引用回帖:
7楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-27 13:59:17:
我说的有机溶剂主要指乙醇，不知你有没有注意到这种情况，当你对RNA跑胶的时候，假设样品5微升，用6X的loadingbuffer理论上只有1微升就够了，但在实际操作的时候，即使你加2微升，那样品仍然会漂浮不沉淀。我们分 ...

嗯嗯~~~再讨论一下，你提到关于+6X loading buffer跑胶的问题...这个我还真没遇到过。你得出的结论是有机溶剂的水溶性影响。然而前面你又提到有机溶剂主要指乙醇...但乙醇和水完全是互溶的，如何产生影响？如果有乙醇残留，也是极微量的，在跑电泳时应该看不出来。我个人的建议是遇到这种情况，用枪头多吹打几次胶孔后再上样，或者重新配置loading buffer，可能蔗糖加少了？~
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10楼2012-04-27 14:17:14
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-29 17:06:35
引用回帖:
14楼: Originally posted by weining1203 at 2012-04-27 17:05:33:
谢谢回复，我就是要反转录然后扩一个基因，这个浓度没问题吧？

我认为没有问题，RT-PCR非常敏感，理想状态下单拷贝的片段也能获得扩增，所以你这个1.2ug的总RNA是够的。当然，我也同意“孙启亮”虫友的观点，如果能提高RNA的量，当然是最好的。因为写文章时，样本的质量对重复性和可靠性是有很大影响的，能不让别人argue那就最好了，不是吗？
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17楼2012-04-28 10:57:03
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