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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取的rna浓度只有60ng/ul，影响逆转录吗，请好心虫友指点
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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] 提取的rna浓度只有60ng/ul，影响逆转录吗，请好心虫友指点

问题如标题，请好心的虫友指点一下。
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1楼2012-04-27 09:19:07
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-27 13:56:21
引用回帖:
3楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-27 10:12:28:
影响，因为你提的RNA无论是否是使用试剂盒，里面都会有有机溶剂什么的，这些有机溶剂都可能是逆转录的抑制剂，你这么低的浓度是不能用于逆转录的。
楼主逆转录之后要PCR吧，试剂盒上可能会说浓度像你这么低就可以 ...

不知道你是否亲手做过RNA提取和反转录等实验，我用过的QIAGEN、TIANGEN的试剂盒提RNA，也用过TRIzol法，还真没遇到过因为有机溶剂残留而影响后续实验的。目前提取RNA的试剂盒大多数用的是异硫氰酸胍裂解结合硅胶柱吸附法，几乎用不到什么有机溶剂。至于TRIzol法，由于要用酚氯仿抽提除蛋白，氯仿确实有可能残留，不过这种可能性...因为水相和有机相分离明显，因此只要操作得当，几乎可以忽略。最后就是沉淀RNA的时候会用到乙醇或异丙醇，这俩玩意儿确实会严重抑制下游实验中酶的活性，但也是可以通过严格遵守操作标准来进行实验而避免的。
最后，我得说，RT-PCR是敏感度非常高的实验操作，因此基因组DNA的污染影响远远大于RNA总量不足的问题，楼主要根据自己的实验目的来判断这些RNA是否可用。
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6楼2012-04-27 13:32:07
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-27 13:55:08
60ng/uL，你应该不止1uL吧？通常逆转录只需要~100ng就很够了，所以你RNA的浓度没问题。关键是RNA完整性如何，是否有基因组DNA污染，这才是影响逆转录及后续实验的关键。
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2楼2012-04-27 10:03:33
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 应助指数+1, 专家考核, 辛苦 2012-04-27 13:55:47
西瓜: 金币+3, MolEPI+1, 专家考核, Good！还是要努力提高一下RNA浓度。 2012-04-29 09:23:15
影响，因为你提的RNA无论是否是使用试剂盒，里面都会有有机溶剂什么的，这些有机溶剂都可能是逆转录的抑制剂，你这么低的浓度是不能用于逆转录的。
楼主逆转录之后要PCR吧，试剂盒上可能会说浓度像你这么低就可以用。但他们想表达的不是这个意思，PCR是很敏感的，这么低的浓度确实能检测出来，但前提是在没有抑制剂的情况下。他们所说的RNA浓度，是指提取之后浓度很高然后稀释到100ng，你这个原始浓度都没有达到很高，体系里面存在的逆转录试剂是PCR的抑制剂，所以是不能用的。
国内有很多人做胚胎干细胞，他们的细胞个数只有32，用专用的试剂盒提取到的RNA浓度虽然很低，但是他们的RNA就可以用于PCR，如果你的是普通的细胞，这么低的浓度是不能使用的。
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3楼2012-04-27 10:12:28
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by holyala at 2012-04-27 10:03:33:
60ng/uL，你应该不止1uL吧？通常逆转录只需要~100ng就很够了，所以你RNA的浓度没问题。关键是RNA完整性如何，是否有基因组DNA污染，这才是影响逆转录及后续实验的关键。

谢谢您的回复，您说地100ng是总rna的量还是mRNA的量啊，逆转录试剂盒要求mRNA的量为50-500ng，我最多加总rna20ul，算起来一共1200ng，但mrna一般只占总rna的1%左右吧，才12ng，是不是太少了。。。
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4楼2012-04-27 10:25:44
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