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weining1203新虫 (小有名气)
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[求助]
提取的rna浓度只有60ng/ul，影响逆转录吗，请好心虫友指点
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-27 13:56:21
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-27 13:56:21
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不知道你是否亲手做过RNA提取和反转录等实验，我用过的QIAGEN、TIANGEN的试剂盒提RNA，也用过TRIzol法，还真没遇到过因为有机溶剂残留而影响后续实验的。目前提取RNA的试剂盒大多数用的是异硫氰酸胍裂解结合硅胶柱吸附法，几乎用不到什么有机溶剂。至于TRIzol法，由于要用酚氯仿抽提除蛋白，氯仿确实有可能残留，不过这种可能性...因为水相和有机相分离明显，因此只要操作得当，几乎可以忽略。最后就是沉淀RNA的时候会用到乙醇或异丙醇，这俩玩意儿确实会严重抑制下游实验中酶的活性，但也是可以通过严格遵守操作标准来进行实验而避免的。 最后，我得说，RT-PCR是敏感度非常高的实验操作，因此基因组DNA的污染影响远远大于RNA总量不足的问题，楼主要根据自己的实验目的来判断这些RNA是否可用。 |
6楼2012-04-27 13:32:07
holyala
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2楼2012-04-27 10:03:33
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 应助指数+1, 专家考核, 辛苦 2012-04-27 13:55:47
西瓜: 金币+3, MolEPI+1, 专家考核, Good！还是要努力提高一下RNA浓度。 2012-04-29 09:23:15
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影响，因为你提的RNA无论是否是使用试剂盒，里面都会有有机溶剂什么的，这些有机溶剂都可能是逆转录的抑制剂，你这么低的浓度是不能用于逆转录的。 楼主逆转录之后要PCR吧，试剂盒上可能会说浓度像你这么低就可以用。但他们想表达的不是这个意思，PCR是很敏感的，这么低的浓度确实能检测出来，但前提是在没有抑制剂的情况下。他们所说的RNA浓度，是指提取之后浓度很高然后稀释到100ng，你这个原始浓度都没有达到很高，体系里面存在的逆转录试剂是PCR的抑制剂，所以是不能用的。 国内有很多人做胚胎干细胞，他们的细胞个数只有32，用专用的试剂盒提取到的RNA浓度虽然很低，但是他们的RNA就可以用于PCR，如果你的是普通的细胞，这么低的浓度是不能使用的。 |
3楼2012-04-27 10:12:28
weining1203
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