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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

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10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 05:08:49
氯仿是抽提酚及帮助分相的,去蛋白最好用酚氯仿,抽提前一般要稀释一下样品,否则体积太小样品的损失很大,抽提完再次沉淀就可以了。...

嗯,谢谢,我昨天用DEPC处理水溶解RNA沉淀后再次直接用氯仿抽提再沉淀洗涤,因为考虑到用酚氯仿会有酚残留不好去除,但是用氯仿去蛋白好像也没有抽提到什么蛋白层,就是分界线基本是比较干净的,洗涤后跑胶比之前的要好,但是好像只有一条带,看得出有降解(看图3),不解的是,我的点样孔与条带之间有一条弯曲的细长白带,感觉又不像DNA污染,因为这个白带在黑暗处就可以看到(看图4),不知道咋回事。。。。
望您能多指点。。。真的感激不尽~~

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思路决定出路。。。
11楼2013-01-21 13:03:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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11楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-01-21 13:03:33
嗯,谢谢,我昨天用DEPC处理水溶解RNA沉淀后再次直接用氯仿抽提再沉淀洗涤,因为考虑到用酚氯仿会有酚残留不好去除,但是用氯仿去蛋白好像也没有抽提到什么蛋白层,就是分界线基本是比较干净的,洗涤后跑胶比之前的 ...

你说在上面的白色条带在黑暗中就能看到是什么意思?成像的时候是放到紫外灯下的吧。dsDNA和sybr green结合是绿色荧光,不应该是白色的呀。你的胶里没有marker,我不是很好判断。植物样品的RNA可以提出不少带呢,既包括细胞本身的RNA,还有叶绿体的RNA。
12楼2013-01-21 15:28:10
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 15:28:10
你说在上面的白色条带在黑暗中就能看到是什么意思?成像的时候是放到紫外灯下的吧。dsDNA和sybr green结合是绿色荧光,不应该是白色的呀。你的胶里没有marker,我不是很好判断。植物样品的RNA可以提出不少带呢,既 ...

你好!我之前的胶有白色的带,我知道是什么原因了,是因为自己的胶制的不好,估计太干了,拔出来的时候损伤了胶,导致有一条带,不过电泳还是有问题,就是DNA Marker老是不清晰,电泳缓冲液(1XTAE)是新配的,染料是sybr Green I稀释100倍后,取1ul与5ul DNAmarker、1ul 6 X loading buffer混匀,稍静置几分钟上样的,琼脂糖胶浓度一般1%左右。

这个问题纳闷了我好久,不知是和原因啊!请多多指教~
思路决定出路。。。
13楼2013-04-01 17:58:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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13楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-04-01 17:58:36
你好!我之前的胶有白色的带,我知道是什么原因了,是因为自己的胶制的不好,估计太干了,拔出来的时候损伤了胶,导致有一条带,不过电泳还是有问题,就是DNA Marker老是不清晰,电泳缓冲液(1XTAE)是新配的,染料 ...

marker不清晰的原因可能是胶配制不均匀或者是电泳条件控制不好。你跑电泳大致多长时间,电压多少?
14楼2013-04-01 23:26:44
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

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14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-01 23:26:44
marker不清晰的原因可能是胶配制不均匀或者是电泳条件控制不好。你跑电泳大致多长时间,电压多少?...

你好!我知道我的电泳图为什么是这样的了,我来解释一下,同时也希望可以对一些像我这样的新手避免发生这样的问题:
第一张电泳图RNA提取的很好,但是拍照的时候漏光了,胶在白光下泛白,当我关了灯后,图像会很清晰。
第二张电泳图是胶没配好,太干了或还没干时拔梳子时,使胶在梳子边缘不同程度的损伤,以前不知道该凝多久没一个度,同学之间的说法并没到重点,其实胶凝不能太干,但半个小时还是应该的,半个 小时后看胶的表面,如果自己能看到水分缺失的样子,那么肯定太干了,肯定会容易损伤凝胶。
marker 不清晰,第一上样量是否够(之前没买过marker,后来才知道marker一般不用稀释了,使用说明看说明书就好),第二核酸染料是否够或没有问题,第三电泳液是否缓冲能力差了,第四上样时是否损伤了凝胶或漂浮,第五:胶浓度不均匀(此时容易跑歪)

另外,RNA我是100v 100mA跑15min,虽然我知道DNA Marker跑不开,但证明我的胶没事,染色清晰就好了。
思路决定出路。。。
15楼2013-04-06 09:48:39
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ps169788

铜虫 (小有名气)

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2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-20 10:39:17
没有见过你的胶的情况。DNA marker稀释40倍是不是倍数多了些?加染料一般要放置几分钟让染料与DNA充分结合。
至于胶从托板滑脱的话,一般就是放回去就可以了。托板只是起到电泳时固定胶的作用。
你可以把RNA先反转 ...

哇,大神啊。
16楼2013-04-06 20:54:04
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