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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA提取及电泳问题（附图），虫友们能否帮我分析下啊~~
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 05:08:49
氯仿是抽提酚及帮助分相的，去蛋白最好用酚氯仿，抽提前一般要稀释一下样品，否则体积太小样品的损失很大，抽提完再次沉淀就可以了。...

嗯，谢谢，我昨天用DEPC处理水溶解RNA沉淀后再次直接用氯仿抽提再沉淀洗涤，因为考虑到用酚氯仿会有酚残留不好去除，但是用氯仿去蛋白好像也没有抽提到什么蛋白层，就是分界线基本是比较干净的，洗涤后跑胶比之前的要好，但是好像只有一条带，看得出有降解（看图3），不解的是，我的点样孔与条带之间有一条弯曲的细长白带，感觉又不像DNA污染，因为这个白带在黑暗处就可以看到（看图4），不知道咋回事。。。。
望您能多指点。。。真的感激不尽~~

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思路决定出路。。。
11楼2013-01-21 13:03:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-01-21 13:03:33
嗯，谢谢，我昨天用DEPC处理水溶解RNA沉淀后再次直接用氯仿抽提再沉淀洗涤，因为考虑到用酚氯仿会有酚残留不好去除，但是用氯仿去蛋白好像也没有抽提到什么蛋白层，就是分界线基本是比较干净的，洗涤后跑胶比之前的 ...

你说在上面的白色条带在黑暗中就能看到是什么意思？成像的时候是放到紫外灯下的吧。dsDNA和sybr green结合是绿色荧光，不应该是白色的呀。你的胶里没有marker，我不是很好判断。植物样品的RNA可以提出不少带呢，既包括细胞本身的RNA，还有叶绿体的RNA。
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12楼2013-01-21 15:28:10
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-21 15:28:10
你说在上面的白色条带在黑暗中就能看到是什么意思？成像的时候是放到紫外灯下的吧。dsDNA和sybr green结合是绿色荧光，不应该是白色的呀。你的胶里没有marker，我不是很好判断。植物样品的RNA可以提出不少带呢，既 ...

你好！我之前的胶有白色的带，我知道是什么原因了，是因为自己的胶制的不好，估计太干了，拔出来的时候损伤了胶，导致有一条带，不过电泳还是有问题，就是DNA Marker老是不清晰，电泳缓冲液（1XTAE）是新配的，染料是sybr Green I稀释100倍后，取1ul与5ul DNAmarker、1ul 6 X loading buffer混匀，稍静置几分钟上样的，琼脂糖胶浓度一般1%左右。

这个问题纳闷了我好久，不知是和原因啊！请多多指教~
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思路决定出路。。。
13楼2013-04-01 17:58:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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13楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-04-01 17:58:36
你好！我之前的胶有白色的带，我知道是什么原因了，是因为自己的胶制的不好，估计太干了，拔出来的时候损伤了胶，导致有一条带，不过电泳还是有问题，就是DNA Marker老是不清晰，电泳缓冲液（1XTAE）是新配的，染料 ...

marker不清晰的原因可能是胶配制不均匀或者是电泳条件控制不好。你跑电泳大致多长时间，电压多少？
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14楼2013-04-01 23:26:44
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-01 23:26:44
marker不清晰的原因可能是胶配制不均匀或者是电泳条件控制不好。你跑电泳大致多长时间，电压多少？...

你好！我知道我的电泳图为什么是这样的了，我来解释一下，同时也希望可以对一些像我这样的新手避免发生这样的问题：
第一张电泳图RNA提取的很好，但是拍照的时候漏光了，胶在白光下泛白，当我关了灯后，图像会很清晰。
第二张电泳图是胶没配好，太干了或还没干时拔梳子时，使胶在梳子边缘不同程度的损伤，以前不知道该凝多久没一个度，同学之间的说法并没到重点，其实胶凝不能太干，但半个小时还是应该的，半个 小时后看胶的表面，如果自己能看到水分缺失的样子，那么肯定太干了，肯定会容易损伤凝胶。
marker 不清晰，第一上样量是否够（之前没买过marker，后来才知道marker一般不用稀释了，使用说明看说明书就好），第二核酸染料是否够或没有问题，第三电泳液是否缓冲能力差了，第四上样时是否损伤了凝胶或漂浮，第五：胶浓度不均匀（此时容易跑歪）

另外，RNA我是100v 100mA跑15min，虽然我知道DNA Marker跑不开，但证明我的胶没事，染色清晰就好了。
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思路决定出路。。。
15楼2013-04-06 09:48:39
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ps169788

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-20 10:39:17
没有见过你的胶的情况。DNA marker稀释40倍是不是倍数多了些？加染料一般要放置几分钟让染料与DNA充分结合。
至于胶从托板滑脱的话，一般就是放回去就可以了。托板只是起到电泳时固定胶的作用。
你可以把RNA先反转 ...

哇，大神啊。
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16楼2013-04-06 20:54:04
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