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lmcyjxs金虫 (正式写手)
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[交流]
RNA提取及电泳问题（附图），虫友们能否帮我分析下啊~~已有3人参与
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虽然我实在不敢拿出来见人了，但极其希望大家能一起帮我看看，我这边实验室很少能找到类似方向的人讨论交流啊~~~~~o(>_< o ~~如图，第一，虽然能跑出条带来，看似也没有降解，但跑的电泳图出现花白的一片，不知道是不是胶制的不好（我在制胶时，胶跟托板粘得不牢，有移动过，TAE放了1个月左右），或是有蛋白杂质污染。 另外就是我跑的电泳图（此时的TAE是新配的了）出现一条弯曲的条带（看第二个图），在暗处就能看到。连DNA marker 也没跑出来，不知道是什么问题。 我用异硫氰酸胍-SDS法提取植物茎RNA，所用的试剂全是自己配的； 至于去蛋白那一步，我用水饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）去了一次，再用氯仿去1次，一般用水饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）去了一次后，再用氯仿去（此步我没有用力震荡，只是稍微振荡再涡旋10来秒），肉眼看两相分层处几乎没有白色蛋白了。 另外我提取的RNA保存-80℃的75%酒精中，这样会有问题吗？关于RNA的保存网上有很很多说法，搞得我不知道该怎么做，虽然可以反转录成cDNA ,但是我引物还没弄好，可以先反转录成cDNA，扩增那块春节后再做吗？如果反转录成cDNA，可以用什么办法检测一下cDNA的质量吗？虫友们能否介绍下保存RNA的方法？ 注： 我的电泳缓冲液是自配的1XTAE液（直接按比例配成20mL的50XTAE液，再稀释成1XTAE液的） 10X10cm规格的胶，电流电压100mA、100V 采用点染法，1%左右的琼脂糖胶，DNAmarker 我稀释了40倍，取5uL与2uL稀释100倍的sybr Green I 混匀，及加1ul的6Xloding buffer上样液跑的。也不知道这样操作有没有问题。 我都想崩溃了，我也不知道哪里出了问题~~望各位虫友多指教啊~~  1.jpg  2.jpg |
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lmcyjxs
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你好！我知道我的电泳图为什么是这样的了，我来解释一下，同时也希望可以对一些像我这样的新手避免发生这样的问题： 第一张电泳图RNA提取的很好，但是拍照的时候漏光了，胶在白光下泛白，当我关了灯后，图像会很清晰。 第二张电泳图是胶没配好，太干了或还没干时拔梳子时，使胶在梳子边缘不同程度的损伤，以前不知道该凝多久没一个度，同学之间的说法并没到重点，其实胶凝不能太干，但半个小时还是应该的，半个 小时后看胶的表面，如果自己能看到水分缺失的样子，那么肯定太干了，肯定会容易损伤凝胶。 marker 不清晰，第一上样量是否够（之前没买过marker，后来才知道marker一般不用稀释了，使用说明看说明书就好），第二核酸染料是否够或没有问题，第三电泳液是否缓冲能力差了，第四上样时是否损伤了凝胶或漂浮，第五：胶浓度不均匀（此时容易跑歪） 另外，RNA我是100v 100mA跑15min，虽然我知道DNA Marker跑不开，但证明我的胶没事，染色清晰就好了。 |
15楼2013-04-06 09:48:39
cicelyzh
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amisking: 回帖置顶 2013-01-20 18:16:05
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没有见过你的胶的情况。DNA marker稀释40倍是不是倍数多了些？加染料一般要放置几分钟让染料与DNA充分结合。 至于胶从托板滑脱的话，一般就是放回去就可以了。托板只是起到电泳时固定胶的作用。 你可以把RNA先反转录成cDNA保存。cDNA比RNA稳定性要好一些。注意把DNA消化好再做反转录。反转录后的cDNA质量是无法检测的。因为反应体系里既有合成出的cDNA也有RNA。而且合成出来的cDNA丰度和分子量不均一。虽然说可以把RNA消化掉，但是一般大家都不这样去做。因为RNA是不影响下面的PCR定量的。 |
2楼2013-01-20 10:39:17
lmcyjxs
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3楼2013-01-20 12:13:01
lmcyjxs
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4楼2013-01-20 12:14:29