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306495799

铁虫 (小有名气)

[求助] RNA提取电泳效果不好

细胞提取的RNA(五个条带),结果图很不理想,组织提取的RNA(两个条带)也是一样,5s前面还有一条很亮的条带,不知道原因在哪里?求论坛高人指点
RNA提取电泳效果不好
20130723rna.JPG


RNA提取电泳效果不好-1
20130722rna.JPG
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也许似乎大概是,然而未必不见得
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
306495799: 金币+40, ★★★很有帮助, 过程要在冰上放置吗?加入异丙醇是不是要轻轻颠倒混匀啊? 2013-07-24 09:30:30
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助! 2013-07-24 11:08:39
你的每个样品主要是有DNA的污染,你的是什么方法提的?试剂是不是自己配的?酚氯仿抽提液是你自己配的吗?如果是,注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候,不要取到中间层,宁愿取少点,够用就行。看的图虽然有DNA污染,但是量是很丰富的。DNA也是溶在水相的,只是在靠近中间层那里。
2 电泳上样量不知你上多少,从第一个图的第一个条带来看,稍大了点,其他基本还好。
3 至于为什么这么多条带,我一时没有想明白,我觉得可能你在提取过程中,震荡过于剧烈造成的,不过这点不确定,你尝试着有些步骤不要振荡太剧烈,以免机械剪切力造成条带断裂。
4 出现这么多条带,还有可能是降解了。你操作过程中尽量注意环境卫生、温度把控,另外提取时,细菌的量不要太多,太多也会易降解的。
祝好!
思路决定出路。。。
2楼2013-07-23 18:36:56
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谢开龙

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
306495799: 金币+10, ★★★很有帮助, 看一下我的前期提取过程有什么问题吗? 2013-07-24 09:31:16
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-07-24 11:08:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-23 18:36:56
你的每个样品主要是有DNA的污染,你的是什么方法提的?试剂是不是自己配的?酚氯仿抽提液是你自己配的吗?如果是,注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候,不要取到中间层,宁愿取少点,够用就行。看的图虽 ...

个人认为,最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前,组织处于冰冻状态。
3楼2013-07-24 00:13:05
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 谢开龙 at 2013-07-24 00:13:05
个人认为,最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前,组织处于冰冻状态。...

你说的对,这点也很重要。
思路决定出路。。。
4楼2013-07-24 00:18:09
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306495799

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 谢开龙 at 2013-07-24 00:13:05
个人认为,最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前,组织处于冰冻状态。...

最下面那一条带是5s?还是从下到上第二条比较模糊的那一条?
也许似乎大概是,然而未必不见得
5楼2013-07-24 08:26:07
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306495799

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 谢开龙 at 2013-07-24 00:13:05
个人认为,最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前,组织处于冰冻状态。...

我是在-80放置,取出放液氮中,一个个拿出来提取RNA的,用的1mL trizoL,室温放置40min,,之后就是氯仿3min,4℃,12000离心10min,然后500uL异丙醇10min,4℃,12000离心10min,再75%乙醇洗涤沉淀,晾干20min,depc水溶解?都用的漩涡震荡,是不是太剧烈了?
也许似乎大概是,然而未必不见得
6楼2013-07-24 08:37:01
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-23 18:36:56
你的每个样品主要是有DNA的污染,你的是什么方法提的?试剂是不是自己配的?酚氯仿抽提液是你自己配的吗?如果是,注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候,不要取到中间层,宁愿取少点,够用就行。看的图虽 ...

1 在冰上操作
2 加入异丙醇后用手上下颠倒一般力度混匀即可,轻轻混匀也没问题,没必要剧烈震荡。
祝好!
思路决定出路。。。
7楼2013-07-24 11:18:37
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longrna

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-23 18:36:56
你的每个样品主要是有DNA的污染,你的是什么方法提的?试剂是不是自己配的?酚氯仿抽提液是你自己配的吗?如果是,注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候,不要取到中间层,宁愿取少点,够用就行。看的图虽 ...

其实这个提取的质量应该是挺好的。
第一道是上样量有点多,二三道是上样量少(或者是提取的浓度低),四五道非常好:26S 16S两条带之间的区域非常干净可以推测没有明显的降解。
1、从电泳图看得到DNA的条带吗?很明显没有嘛。点样孔亮有两个可能:一是有蛋白污染二是制胶的问题。
2、机械剪切造成的降解我觉得可能性比较小。

另外,楼主在加完Trizol后室温放置不用40min那么久,有5-10min足够了。但前提是要研磨充分(不过就算不充分你静置再久也没有用)。
伟大航线....
8楼2013-07-24 12:15:34
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by longrna at 2013-07-24 12:15:34
其实这个提取的质量应该是挺好的。
第一道是上样量有点多,二三道是上样量少(或者是提取的浓度低),四五道非常好:26S 16S两条带之间的区域非常干净可以推测没有明显的降解。
1、从电泳图看得到DNA的条带吗?很 ...

应该是有DNA污染的,这个看上去不像是制胶的问题,当然不反对有这个因素,另外,我也想提几个问题,希望可以一起探讨下:
  1 有些泳道,我看也不像降解,比如第一个图的第四五个样品,从亮度比例看,质量是不错,但是出现那么多带,我是没有想明白,能解释下吗?
  2 如果楼主是新手,蛋白污染存在很正常,且细菌含蛋白应该是比较多的,不过蛋白本身不会有荧光吧?蛋白会影响荧光及RNA或DNA迁移速率。
  3 过强的机械剪切可能会造成大分子RNA或DNA断裂,所以可能会出现多条带,而不是降解。
  4 我觉得,还应该建议楼主测下DNA的纯度,调整上样量,制好胶,一步步排除问题,解决问题。
思路决定出路。。。
9楼2013-07-24 16:27:13
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306495799

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-24 16:27:13
应该是有DNA污染的,这个看上去不像是制胶的问题,当然不反对有这个因素,另外,我也想提几个问题,希望可以一起探讨下:
  1 有些泳道,我看也不像降解,比如第一个图的第四五个样品,从亮度比例看,质量是不错, ...

测了浓度,都达到了2ug/ul,但是A260/280才1.77~1.9,A260/240才1.4~1.8,制胶有点急了,还没有完全凝好我就点样跑电泳了。
也许似乎大概是,然而未必不见得
10楼2013-07-24 21:39:00
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