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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA提取电泳效果不好
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306495799

铁虫 (小有名气)

[求助] RNA提取电泳效果不好

细胞提取的RNA（五个条带），结果图很不理想，组织提取的RNA（两个条带）也是一样，5s前面还有一条很亮的条带，不知道原因在哪里？求论坛高人指点
RNA提取电泳效果不好
20130723rna.JPG


RNA提取电泳效果不好-1
20130722rna.JPG
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也许似乎大概是，然而未必不见得
1楼 2013-07-23 16:53:38
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
306495799: 金币+40, ★★★很有帮助, 过程要在冰上放置吗？加入异丙醇是不是要轻轻颠倒混匀啊？ 2013-07-24 09:30:30
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-24 11:08:39
你的每个样品主要是有DNA的污染，你的是什么方法提的？试剂是不是自己配的？酚氯仿抽提液是你自己配的吗？如果是，注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候，不要取到中间层，宁愿取少点，够用就行。看的图虽然有DNA污染，但是量是很丰富的。DNA也是溶在水相的，只是在靠近中间层那里。
2 电泳上样量不知你上多少，从第一个图的第一个条带来看，稍大了点，其他基本还好。
3 至于为什么这么多条带，我一时没有想明白，我觉得可能你在提取过程中，震荡过于剧烈造成的，不过这点不确定，你尝试着有些步骤不要振荡太剧烈，以免机械剪切力造成条带断裂。
4 出现这么多条带，还有可能是降解了。你操作过程中尽量注意环境卫生、温度把控，另外提取时，细菌的量不要太多，太多也会易降解的。
祝好！
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思路决定出路。。。
2楼2013-07-23 18:36:56
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谢开龙

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
306495799: 金币+10, ★★★很有帮助, 看一下我的前期提取过程有什么问题吗？ 2013-07-24 09:31:16
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-24 11:08:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-23 18:36:56
你的每个样品主要是有DNA的污染，你的是什么方法提的？试剂是不是自己配的？酚氯仿抽提液是你自己配的吗？如果是，注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候，不要取到中间层，宁愿取少点，够用就行。看的图虽 ...

个人认为，最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前，组织处于冰冻状态。
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3楼2013-07-24 00:13:05
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 谢开龙 at 2013-07-24 00:13:05
个人认为，最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前，组织处于冰冻状态。...

你说的对，这点也很重要。
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思路决定出路。。。
4楼2013-07-24 00:18:09
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 谢开龙 at 2013-07-24 00:13:05
个人认为，最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前，组织处于冰冻状态。...

最下面那一条带是5s？还是从下到上第二条比较模糊的那一条？
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也许似乎大概是，然而未必不见得
5楼2013-07-24 08:26:07
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 谢开龙 at 2013-07-24 00:13:05
个人认为，最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前，组织处于冰冻状态。...

我是在-80放置，取出放液氮中，一个个拿出来提取RNA的，用的1mL trizoL，室温放置40min，，之后就是氯仿3min，4℃，12000离心10min，然后500uL异丙醇10min，4℃，12000离心10min，再75%乙醇洗涤沉淀，晾干20min，depc水溶解？都用的漩涡震荡，是不是太剧烈了？
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也许似乎大概是，然而未必不见得
6楼2013-07-24 08:37:01
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-23 18:36:56
你的每个样品主要是有DNA的污染，你的是什么方法提的？试剂是不是自己配的？酚氯仿抽提液是你自己配的吗？如果是，注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候，不要取到中间层，宁愿取少点，够用就行。看的图虽 ...

1 在冰上操作
2 加入异丙醇后用手上下颠倒一般力度混匀即可，轻轻混匀也没问题，没必要剧烈震荡。
祝好！
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思路决定出路。。。
7楼2013-07-24 11:18:37
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longrna

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-23 18:36:56
你的每个样品主要是有DNA的污染，你的是什么方法提的？试剂是不是自己配的？酚氯仿抽提液是你自己配的吗？如果是，注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候，不要取到中间层，宁愿取少点，够用就行。看的图虽 ...

其实这个提取的质量应该是挺好的。
第一道是上样量有点多，二三道是上样量少（或者是提取的浓度低），四五道非常好：26S 16S两条带之间的区域非常干净可以推测没有明显的降解。
1、从电泳图看得到DNA的条带吗？很明显没有嘛。点样孔亮有两个可能：一是有蛋白污染二是制胶的问题。
2、机械剪切造成的降解我觉得可能性比较小。

另外，楼主在加完Trizol后室温放置不用40min那么久，有5-10min足够了。但前提是要研磨充分（不过就算不充分你静置再久也没有用）。
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伟大航线....
8楼2013-07-24 12:15:34
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by longrna at 2013-07-24 12:15:34
其实这个提取的质量应该是挺好的。
第一道是上样量有点多，二三道是上样量少（或者是提取的浓度低），四五道非常好：26S 16S两条带之间的区域非常干净可以推测没有明显的降解。
1、从电泳图看得到DNA的条带吗？很 ...

应该是有DNA污染的，这个看上去不像是制胶的问题，当然不反对有这个因素，另外，我也想提几个问题，希望可以一起探讨下：
  1 有些泳道，我看也不像降解，比如第一个图的第四五个样品，从亮度比例看，质量是不错，但是出现那么多带，我是没有想明白，能解释下吗？
  2 如果楼主是新手，蛋白污染存在很正常，且细菌含蛋白应该是比较多的，不过蛋白本身不会有荧光吧？蛋白会影响荧光及RNA或DNA迁移速率。
  3 过强的机械剪切可能会造成大分子RNA或DNA断裂，所以可能会出现多条带，而不是降解。
  4 我觉得，还应该建议楼主测下DNA的纯度，调整上样量，制好胶，一步步排除问题，解决问题。
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思路决定出路。。。
9楼2013-07-24 16:27:13
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306495799

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-24 16:27:13
应该是有DNA污染的，这个看上去不像是制胶的问题，当然不反对有这个因素，另外，我也想提几个问题，希望可以一起探讨下：
  1 有些泳道，我看也不像降解，比如第一个图的第四五个样品，从亮度比例看，质量是不错， ...

测了浓度，都达到了2ug/ul，但是A260/280才1.77~1.9,A260/240才1.4~1.8，制胶有点急了，还没有完全凝好我就点样跑电泳了。
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10楼2013-07-24 21:39:00
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