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306495799

铁虫 (小有名气)

[求助] RNA提取电泳效果不好

细胞提取的RNA(五个条带),结果图很不理想,组织提取的RNA(两个条带)也是一样,5s前面还有一条很亮的条带,不知道原因在哪里?求论坛高人指点
RNA提取电泳效果不好
20130723rna.JPG


RNA提取电泳效果不好-1
20130722rna.JPG
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longrna

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-23 18:36:56
你的每个样品主要是有DNA的污染,你的是什么方法提的?试剂是不是自己配的?酚氯仿抽提液是你自己配的吗?如果是,注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候,不要取到中间层,宁愿取少点,够用就行。看的图虽 ...

其实这个提取的质量应该是挺好的。
第一道是上样量有点多,二三道是上样量少(或者是提取的浓度低),四五道非常好:26S 16S两条带之间的区域非常干净可以推测没有明显的降解。
1、从电泳图看得到DNA的条带吗?很明显没有嘛。点样孔亮有两个可能:一是有蛋白污染二是制胶的问题。
2、机械剪切造成的降解我觉得可能性比较小。

另外,楼主在加完Trizol后室温放置不用40min那么久,有5-10min足够了。但前提是要研磨充分(不过就算不充分你静置再久也没有用)。
伟大航线....
8楼2013-07-24 12:15:34
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
306495799: 金币+40, ★★★很有帮助, 过程要在冰上放置吗?加入异丙醇是不是要轻轻颠倒混匀啊? 2013-07-24 09:30:30
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助! 2013-07-24 11:08:39
你的每个样品主要是有DNA的污染,你的是什么方法提的?试剂是不是自己配的?酚氯仿抽提液是你自己配的吗?如果是,注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候,不要取到中间层,宁愿取少点,够用就行。看的图虽然有DNA污染,但是量是很丰富的。DNA也是溶在水相的,只是在靠近中间层那里。
2 电泳上样量不知你上多少,从第一个图的第一个条带来看,稍大了点,其他基本还好。
3 至于为什么这么多条带,我一时没有想明白,我觉得可能你在提取过程中,震荡过于剧烈造成的,不过这点不确定,你尝试着有些步骤不要振荡太剧烈,以免机械剪切力造成条带断裂。
4 出现这么多条带,还有可能是降解了。你操作过程中尽量注意环境卫生、温度把控,另外提取时,细菌的量不要太多,太多也会易降解的。
祝好!
思路决定出路。。。
2楼2013-07-23 18:36:56
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谢开龙

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
306495799: 金币+10, ★★★很有帮助, 看一下我的前期提取过程有什么问题吗? 2013-07-24 09:31:16
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-07-24 11:08:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-23 18:36:56
你的每个样品主要是有DNA的污染,你的是什么方法提的?试剂是不是自己配的?酚氯仿抽提液是你自己配的吗?如果是,注意酚要选水饱和酚。
1 你在每次取上清的时候,不要取到中间层,宁愿取少点,够用就行。看的图虽 ...

个人认为,最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前,组织处于冰冻状态。
3楼2013-07-24 00:13:05
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 谢开龙 at 2013-07-24 00:13:05
个人认为,最容易使RNA降解的步骤是磨样的时候。一定保证加入第一次加入溶液前,组织处于冰冻状态。...

你说的对,这点也很重要。
思路决定出路。。。
4楼2013-07-24 00:18:09
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