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longrna

新虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by lmcyjxs at 2013-07-24 16:27:13
应该是有DNA污染的,这个看上去不像是制胶的问题,当然不反对有这个因素,另外,我也想提几个问题,希望可以一起探讨下:
  1 有些泳道,我看也不像降解,比如第一个图的第四五个样品,从亮度比例看,质量是不错, ...

共同探讨
1、提取RNA电泳出现多条带这种现象是跟样品(物种以及物种所处生长时期)有关。有些物种28S非常弱,电泳上样量少甚至看不到,造成所提RNA只有一条18S的假象。也有一些物种存在大量其他细胞器(如叶绿体等)的RNA。或者是一些RNA转录前体等....
2、如果此样品蛋白含量多可以减少样品用量。但在加氯仿振荡混匀这一步必须充分,或可以使用用氯仿抽提两次对去蛋白有帮助。
3、我觉得如果是机械力造成的断裂应该是随机的,即断裂后的片段大小应该是随机的(即迷散,1000nt  601nt 399nt 400nt 600nt....)。断成同一个长度的可能性不大。多带表明片段大小是一致的。(参考基因组DNA提取,如果真正操作剧烈提出来是拖尾,即主带以下弥散,很少见基因组提取出来是多条带的吧?)
4、非常赞同。

纯属个人意见,各位大神指教。
伟大航线....
11楼2013-07-25 09:18:19
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谢开龙

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 306495799 at 2013-07-24 08:37:01
我是在-80放置,取出放液氮中,一个个拿出来提取RNA的,用的1mL trizoL,室温放置40min,,之后就是氯仿3min,4℃,12000离心10min,然后500uL异丙醇10min,4℃,12000离心10min,再75%乙醇洗涤沉淀,晾干20min,d ...

我一般都拿个秒表,涡旋1min........
12楼2013-07-25 12:27:28
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by longrna at 2013-07-25 09:18:19
共同探讨
1、提取RNA电泳出现多条带这种现象是跟样品(物种以及物种所处生长时期)有关。有些物种28S非常弱,电泳上样量少甚至看不到,造成所提RNA只有一条18S的假象。也有一些物种存在大量其他细胞器(如叶绿体等 ...

你好!很高兴与你探讨,学习了!
同意第二条及第三条,至于第一条,我自己倒真的是学习了!我有看过提取叶子类的RNA往往会出现多条带的,因为含大量叶绿体的缘故。
如果基于第一条说的情况,考虑到蛋白污染是常有的,只要不足以干扰实验就好,只是不知道楼主的实验目的是什么了。
因此,我觉得楼主的RNA测纯度OK,其实就可以往下做做看了。从楼主的OD值来看,有些质量是可以的,可以挑比较好的值抓紧往下做,你觉得呢?
思路决定出路。。。
13楼2013-07-25 12:58:39
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