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vivian26

银虫 (小有名气)

[求助] 关于RNA电泳的一些疑惑

作为分子生物学的初学者，我最近准备做RNA电泳，有一些疑惑，在这里向各位大人们请教，希望得到解答。：
1、RNA电泳是否可以直接使用琼脂糖胶？我看到很多人说应该使用变性胶。
2、RNA电泳的loading buffer与Marker是否是专有的？可不可以直接使用DNA电泳的呢？
3、电泳之后很多人说会出现三条带。是三条带一起出现吗？有没有亮度的区别呢？
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世界上最浪漫的事情：执子之手，与子偕老。
1楼 2012-08-10 08:51:04
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涌动的泉

铜虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-08-10 13:49:38
我提的是总RNA
第一个问题：我用的就是1%~1.5%的琼脂糖凝胶
第二个问题：我用的loading buffer 是通用的，Marker是用的DNAmaker2000
第三个问题：的确是三条带，理论上说是28s与18s比较亮，5s较淡时就是比较好的，如果5s很亮的话说明RNA降解了
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我们的过去，成就了如今的我们，无需悔恨
2楼2012-08-10 09:16:32
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普通回帖

tiani_tan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
vivian26: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-08-12 00:00:18
主要看你的目的是什么。（以下内容仅限于普通的rt-pcr及qPCR）
1：电泳，用琼脂糖就行，1%即可，至于变性，如果质量要求高的话可以试试，但比较麻烦。
2：loadingbuffer可以用DNA电泳的，但若使用marker的话，有RNA电泳专用的，DNA marker毕竟和RNA结构不一样。也有说28S rRNA在2000bp的上方，不知道准不准。不用marker也行，毕竟你不需要知道大小，只要提出出总RNA，质量没问题就行。
3：理论上时三条带，28S是18S的2倍，质量好的话5S看不到，一般都会有点降解，所以都会看见5S。
PS：质量和浓度还可以通过紫外分光光度计测量A230，A260，A280看比值
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3楼2012-08-10 20:47:36
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
回答以上问题：
1：可以用琼脂糖电泳（1-2%），主要是检测提起RNA的量，看看有否降解，假如后续要做RT-PCR，还需要进行RNA处理，取出DNA污染。
2：一般跑RNA电泳时最好换新鲜的电泳液，电泳槽最好清洗一下，DNAMarker2000就够了，主要检测3条带。
3：电泳后出现3条带，说明提取的RNA质量高，28S:18S=2:1
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
4楼2012-08-10 21:13:49
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vivian26

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tiani_tan at 2012-08-10 20:47:36
主要看你的目的是什么。（以下内容仅限于普通的rt-pcr及qPCR）
1：电泳，用琼脂糖就行，1%即可，至于变性，如果质量要求高的话可以试试，但比较麻烦。
2：loadingbuffer可以用DNA电泳的，但若使用marker的话，有R ...

那么像是这样的电泳图，5S\18S\28S分别是指哪些条带呢？请帮我分析一下。这个的话就是用的DNA的loading buffer与Marker。最左和最右的两孔分别是Marker。
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5楼2012-08-11 10:11:39
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qiaoxianying

银虫 (初入文坛)
回答：1.用百分之一的琼脂糖凝胶就可以，但要DEPC过夜处理的1*TAE，并高压灭菌
        2.buffer和DL2000是通用的，但使用前也要DEPC处理
        3.如果提取成功的话是有三条带
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6楼2012-08-11 23:13:21
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qiaoxianying

银虫 (初入文坛)
这是RNA吗，右边三条有基因组污染，杂质太多，建议你重新提取，你把具体步骤说一下，我帮你看看
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7楼2012-08-11 23:19:03
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vivian26

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by qiaoxianying at 2012-08-11 23:19:03
这是RNA吗，右边三条有基因组污染，杂质太多，建议你重新提取，你把具体步骤说一下，我帮你看看

提取过程如下所示：
1、trizol处理5min。加入1/5体积氯仿，剧烈震摇30s。4度12000rpm离心10min。
2、取最上层到新的EP管内，加入等体积氯仿。4度12000rpm离心10min。
3、取上清到新的EP管中，加入等体积异丙醇，-20度沉淀约8h。4度12000rpm离心10min。
4、弃上清。加入与trizol等体积的75%冰乙醇。4度7500rpm离心5min。
5、弃上清，室温挥干乙醇。加入一定量的DEPC水溶解。
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世界上最浪漫的事情：执子之手，与子偕老。
8楼2012-08-11 23:52:50
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vivian26

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by qiaoxianying at 2012-08-11 23:19:03
这是RNA吗，右边三条有基因组污染，杂质太多，建议你重新提取，你把具体步骤说一下，我帮你看看

是中间那些相对暗的条带就是污染的吗？最上面和最下面的很亮的条带又是什么呢？
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世界上最浪漫的事情：执子之手，与子偕老。
9楼2012-08-11 23:56:01
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vivian26

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by qiaoxianying at 2012-08-11 23:13:21
回答：1.用百分之一的琼脂糖凝胶就可以，但要DEPC过夜处理的1*TAE，并高压灭菌
        2.buffer和DL2000是通用的，但使用前也要DEPC处理
        3.如果提取成功的话是有三条带

也就是说1*TAE和buffer的要求更高，与DNA电泳相比，是吗？如果降解的话会有什么现象呢？是拖尾吗？
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世界上最浪漫的事情：执子之手，与子偕老。
10楼2012-08-11 23:59:28
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