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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA 提取如何保证质量
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sunzhengwang

铁虫 (小有名气)

[求助] RNA 提取如何保证质量 已有1人参与

最近在反复提取细胞RNA,但是提取出来的RNA A260/280和A260/230都在(2.0-2.1)这个范围，各位大神们给点经验，帮帮我吧
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一手生存，一手梦想
1楼 2013-02-28 09:53:52
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bioluke

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-03-01 13:43:07
如果用的是trizol法，一开始的研磨要尽量破碎，建议液氮+超声波一起用；取上清的时候接近白层部分不要（宁缺毋滥）；留下白色沉淀与管底壁后，再短暂离心吸除管壁剩余上清；OD值在1.8-2.0均可，你这个范围说明RNA有降解，可能是没用低温离心机造成的（也可能细胞本身时间过长降解）？如果用的是试剂盒法，那也是类似的在研磨和去上清步骤中要注意。另外一般来说OD值只是参考，跑胶才更准确些。祝你成功
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4楼2013-02-28 15:33:24
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看吸光度，杂质好像有点多，你能上个胶图看看吗
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2楼2013-02-28 10:41:06
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肖嘉毅

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-01 13:42:50
你是用Trizol提取的吗？细胞的RNA很好提取的，最好用Trizol直接将细胞裂解下来。至于OD比值只是个参考，RNA最理想的不是2.0吗，我之前提组织RNA OD比值在1.65左右时跑胶也能看到挺好的结果，RNA提完后跑胶是最好的检测方式。
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3楼2013-02-28 14:41:38
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lidonghong

金虫 (正式写手)

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感谢参与，应助指数 +1
提取的RNA看质量最好的方法不是测OD值，而是跑胶观察，建议你跑个胶看看，另外提取RNA时要注意各种器具的灭酶处理，另外实验过程勤换手套。
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生物化学与分子生物学
5楼2013-02-28 16:37:43
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scilencing

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2013-03-01 13:43:20
RNA提取过程有许多细节问题需注意：
1、提取过程所用的EP管、移液头都需要用DEPC水进行处理、干燥、高温高压灭菌。
2、提取操作最好在超净工作台中进行，需要配带一次手套，而且手套不能多次重复使用。
3、在分离两相液体时，注意操作轻柔、匀速，两相间的界面，吸取液体不能混有临界层。
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6楼2013-03-01 10:58:25
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sunzhengwang

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 追梦的人1987 at 2013-02-28 10:41:06
看吸光度，杂质好像有点多，你能上个胶图看看吗

跑了胶，出来三条带，貌似效果还可以；
就是嫌那个A260/A280有点高
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一手生存，一手梦想
7楼2013-03-01 12:21:18
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sunzhengwang

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肖嘉毅 at 2013-02-28 14:41:38
你是用Trizol提取的吗？细胞的RNA很好提取的，最好用Trizol直接将细胞裂解下来。至于OD比值只是个参考，RNA最理想的不是2.0吗，我之前提组织RNA OD比值在1.65左右时跑胶也能看到挺好的结果，RNA提完后跑胶是最好的检 ...

嗯，直接裂解，都没有在冰上操作，
我想我找到原因了：加氯仿后，吸取的时候我直接用1ml的枪头吸取的，下次 要换200ul的吸取
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一手生存，一手梦想
8楼2013-03-01 12:29:05
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sunzhengwang

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bioluke at 2013-02-28 15:33:24
如果用的是trizol法，一开始的研磨要尽量破碎，建议液氮+超声波一起用；取上清的时候接近白层部分不要（宁缺毋滥）；留下白色沉淀与管底壁后，再短暂离心吸除管壁剩余上清；OD值在1.8-2.0均可，你这个范围说明RNA有 ...

嗯，提取时间有点长，下次要加快速度
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一手生存，一手梦想
9楼2013-03-01 12:29:47
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sunzhengwang

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lidonghong at 2013-02-28 16:37:43
提取的RNA看质量最好的方法不是测OD值，而是跑胶观察，建议你跑个胶看看，另外提取RNA时要注意各种器具的灭酶处理，另外实验过程勤换手套。

先测了OD，然后再跑胶；
1ulRNA+4ulDEPC WATER+ 1ul 6* loading buffer
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一手生存，一手梦想
10楼2013-03-01 12:31:01
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