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dingcong1216新虫 (小有名气)
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电泳图引物条带很亮，目的产物条带不亮 已有6人参与
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PCR后跑电泳发现引物条带很亮，目的产物条带不亮。PCR程序为 94℃ 5min 94℃ 40S 52℃ 40S 72℃ 40S 38循环 72℃ 10min 4℃ 电泳120v 35min 最右边的两个是我的，右二为不加cDNA的对照，右一是加了模板的图。 请各位大侠给点儿建议，怎样优化一下条件  dell 2014-03-26 11 时 50 分.jpg |
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dingcong1216
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2楼2014-03-26 16:11:36
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3楼2014-03-26 18:02:07
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目标产物的亮度小，说明其量少，引物量说明引物量多，各人以为原因很多，一：引物与模板链的特异性不高，也就是说在延伸是只要一小部分能与模板结合，且引物的设计有问题。二：变性时出问题了，可能变性不完全。其次可以考虑体系中的离子强度，聚合酶特点，模板的熔点，平台效应，还有就是跑胶别太心急，低压长时跑的条带更漂亮。我也是刚解除pcr，有什么不对的地方，望谅解！！！ [ 发自小木虫客户端 ] |
4楼2014-03-26 20:52:18
wangweijian
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6楼2014-03-30 23:11:21
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dingcong1216: 金币+1, ★有帮助 2014-04-30 17:17:32
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可以从以下几点考虑可能的问题所在： 首先，如果不是扩增很长的片段，不需要38个循环这么长，一般30个循环就进入平台期了，32个循环足矣。 其次，如果是同源引物，体系中引物终浓度在0.2uM就行，引物多了反而有可能抑制结合延伸。 第三，若果是cDNA作为模版，最好采用热启动。 可用的解决办法：把第一轮扩增产物稀释至少100倍后作为模板，再扩增一轮，产物的量可能就达到你的实验要求了 |
7楼2014-03-31 01:07:51
【答案】应助回帖
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dingcong1216(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:26:51
dingcong1216(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-17 12:26:51
| 给你几个建议：一、请指明你说用的MARKER类型、目的条带大概长度；二、把你的引物序列也一同放在上面，分子、基因这块的影响因素很多、不确定性很高，需要很多条件来帮你分析排查原因；三、一般引物较短的情况下，变性、复性和延伸的时间比例为1:1:2的关系，你可以分别设置为30s、30s、60s，或者是40s、40s、90s；四、把你的PCR体系放上来，出现引物二聚体的原因可能是引物浓度过高或者是引物的特异性不高，你就只给我们一个PCR成像图和反应参数，我们没办法具体分析，希望你下次能注意些儿。 |
8楼2014-07-17 09:18:39
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