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dingcong1216

新虫 (小有名气)

[求助] 电泳图引物条带很亮,目的产物条带不亮 已有6人参与

PCR后跑电泳发现引物条带很亮,目的产物条带不亮。PCR程序为
     94℃  5min
     94℃  40S  
     52℃  40S
     72℃  40S    38循环
     72℃ 10min
      4℃
电泳120v 35min
最右边的两个是我的,右二为不加cDNA的对照,右一是加了模板的图。
请各位大侠给点儿建议,怎样优化一下条件

电泳图引物条带很亮,目的产物条带不亮
dell 2014-03-26 11 时 50 分.jpg
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月夜饮雪

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-03-27 15:15:17
dingcong1216: 金币+1, 有帮助 2014-04-30 17:18:19
目标产物的亮度小,说明其量少,引物量说明引物量多,各人以为原因很多,一:引物与模板链的特异性不高,也就是说在延伸是只要一小部分能与模板结合,且引物的设计有问题。二:变性时出问题了,可能变性不完全。其次可以考虑体系中的离子强度,聚合酶特点,模板的熔点,平台效应,还有就是跑胶别太心急,低压长时跑的条带更漂亮。我也是刚解除pcr,有什么不对的地方,望谅解!!!

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-03-26 20:52:18
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dingcong1216

新虫 (小有名气)

注:目的产物是224bp
2楼2014-03-26 16:11:36
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wangweijian

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-27 15:15:22
dingcong1216: 金币+1 2014-04-30 17:18:30
适当提高下退火温度,如55℃试试。
5楼2014-03-27 13:29:40
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cm8002

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dingcong1216(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖交流! 2014-03-31 20:23:24
如上所说,提高退火温度;缩短退火时间;减少循环次数;延伸时间也可以相应缩短,一般的酶延伸速度1000bp/min
6楼2014-03-30 23:11:21
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