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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 电泳图引物条带很亮，目的产物条带不亮
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dingcong1216

新虫 (小有名气)

[求助] 电泳图引物条带很亮，目的产物条带不亮 已有6人参与

PCR后跑电泳发现引物条带很亮，目的产物条带不亮。PCR程序为
     94℃  5min
     94℃  40S  
     52℃  40S
     72℃  40S    38循环
     72℃ 10min
      4℃
电泳120v 35min
最右边的两个是我的，右二为不加cDNA的对照，右一是加了模板的图。
请各位大侠给点儿建议，怎样优化一下条件

电泳图引物条带很亮，目的产物条带不亮
dell 2014-03-26 11 时 50 分.jpg
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1楼 2014-03-26 16:10:34
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怎么都行

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dingcong1216(gyesang代发): 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 20:23:31
dingcong1216: 金币+1, ★有帮助 2014-04-30 17:17:32
可以从以下几点考虑可能的问题所在：
首先，如果不是扩增很长的片段，不需要38个循环这么长，一般30个循环就进入平台期了，32个循环足矣。
其次，如果是同源引物，体系中引物终浓度在0.2uM就行，引物多了反而有可能抑制结合延伸。
第三，若果是cDNA作为模版，最好采用热启动。
可用的解决办法：把第一轮扩增产物稀释至少100倍后作为模板，再扩增一轮，产物的量可能就达到你的实验要求了
赞一下(2人) 回复此楼
7楼2014-03-31 01:07:51
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dingcong1216

新虫 (小有名气)
注：目的产物是224bp
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2楼2014-03-26 16:11:36
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月夜饮雪

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-03-27 15:15:17
dingcong1216: 金币+1, ★有帮助 2014-04-30 17:18:19
目标产物的亮度小，说明其量少，引物量说明引物量多，各人以为原因很多，一：引物与模板链的特异性不高，也就是说在延伸是只要一小部分能与模板结合，且引物的设计有问题。二：变性时出问题了，可能变性不完全。其次可以考虑体系中的离子强度，聚合酶特点，模板的熔点，平台效应，还有就是跑胶别太心急，低压长时跑的条带更漂亮。我也是刚解除pcr，有什么不对的地方，望谅解！！！

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2014-03-26 20:52:18
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wangweijian

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-27 15:15:22
dingcong1216: 金币+1 2014-04-30 17:18:30
适当提高下退火温度，如55℃试试。
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5楼2014-03-27 13:29:40
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