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dingcong1216新虫 (小有名气)
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[求助]
电泳图引物条带很亮，目的产物条带不亮 已有6人参与
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PCR后跑电泳发现引物条带很亮，目的产物条带不亮。PCR程序为 94℃ 5min 94℃ 40S 52℃ 40S 72℃ 40S 38循环 72℃ 10min 4℃ 电泳120v 35min 最右边的两个是我的，右二为不加cDNA的对照，右一是加了模板的图。 请各位大侠给点儿建议，怎样优化一下条件  dell 2014-03-26 11 时 50 分.jpg |
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怎么都行
银虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dingcong1216(gyesang代发): 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 20:23:31
dingcong1216: 金币+1, ★有帮助 2014-04-30 17:17:32
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dingcong1216: 金币+1, ★有帮助 2014-04-30 17:17:32
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可以从以下几点考虑可能的问题所在： 首先，如果不是扩增很长的片段，不需要38个循环这么长，一般30个循环就进入平台期了，32个循环足矣。 其次，如果是同源引物，体系中引物终浓度在0.2uM就行，引物多了反而有可能抑制结合延伸。 第三，若果是cDNA作为模版，最好采用热启动。 可用的解决办法：把第一轮扩增产物稀释至少100倍后作为模板，再扩增一轮，产物的量可能就达到你的实验要求了 |
7楼2014-03-31 01:07:51
dingcong1216
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2楼2014-03-26 16:11:36
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-03-27 15:15:17
dingcong1216: 金币+1, ★有帮助 2014-04-30 17:18:19
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dingcong1216: 金币+1, ★有帮助 2014-04-30 17:18:19
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目标产物的亮度小，说明其量少，引物量说明引物量多，各人以为原因很多，一：引物与模板链的特异性不高，也就是说在延伸是只要一小部分能与模板结合，且引物的设计有问题。二：变性时出问题了，可能变性不完全。其次可以考虑体系中的离子强度，聚合酶特点，模板的熔点，平台效应，还有就是跑胶别太心急，低压长时跑的条带更漂亮。我也是刚解除pcr，有什么不对的地方，望谅解！！！ [ 发自小木虫客户端 ] |
4楼2014-03-26 20:52:18
wangweijian
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5楼2014-03-27 13:29:40
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