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质粒分别酶切均有正确条带，但双酶切只有一条条带，这是怎么回事？已有3人参与
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我的片段长度为5400bp左右，连接到POK12载体，载体长度为2400bp。由于长片段连接太难，所以我将片段一分为二，分别为3200bp和2600bp。分别连接入pok中。再将两段连接起来。经PCR鉴定为阳性的菌液提取质粒进行酶切鉴定。片段1的双酶切为MluI和NdeI，片段2的双酶切为NdeI和EcoRV；同时使用MluI和EcoRV对整个片段进行酶切。第一行为片段1的双酶切，第二行为片段2的双酶切，均有目的条带，第三行为整个片段的酶切，但是没有pok质粒条带，只有单一的一条带，三个酶切使用的是同一个质粒，请问这是怎么回事？我到底是连上了还是没连上啊……请大家帮忙看一下分析一下其中的问题。Marker从上到下的大小为5000，3000，2000，1500，800，500，300 20150318-2.jpg |
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4楼2015-03-19 09:12:51
whdxhxy
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2楼2015-03-18 20:57:19
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【答案】应助回帖
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Double Digest Recommendations for MluI + NdeI: Digest in NEBuffer 3.1 at 37°C. 如果用NEB的酶，以后双酶切，先在以下网站找用哪个buffer. http://international.neb.com/too ... ouble-digest-finder 如果换成Fermentas的酶，是只有一个buffer的，就不用担心双酶切buffer不合适。 |
5楼2015-03-19 11:25:35