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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp
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kittykbh

铜虫 (正式写手)

[求助] TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp 已有6人参与

小妹真心无语了，时隔半年还是同样的结果，之前用的是takara的pmd19-T，现在换了高级的invitrogen TOPO TA clone kit，结果还是这个样子。
求助各位实验大牛。

简单介绍一下，是用mobio Powersoil DNA提取土壤总DNA，然后扩的27f-1492r全长，虽然有点小拖带，但是p出来的主带还是够明亮的，能看出来是一条直线。
用的omgea gel extraction kit做的切胶回收。然后连接转化，氨苄青霉素钠自己溶解的粉末100mg/ul, 板子白色菌落正常，没有糊满板，都是零星单菌落，每板大概50-100个单菌落。
挑菌做菌落pcr， 如下图所示：

其中下板比较亮的是我用Sigma设计的 M13-47/RV-M， 上面小板比较弱的是TOPO自带引物一对M13，结果全都是150bp。

按理说invitrogen TOPO TA克隆用过的人都说不会有几个假阳性的，我这个看起来就是全部假阳性，包括之前做的Takara的载体的情况如出一辙。

我现在觉得是我自己的问题，但是又不清楚是哪个环节出现了问题，或者纯化后的PCR产物有自带载体自连的什么物质？

之前在国内用的天根一套没有一点问题，我现在纠结了这么久，真的快崩溃了~~~

TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp
TOPO TA clone.jpg
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1楼 2015-01-13 22:00:17
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494118250

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kittykbh(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:07:42
不知道你的片段多长，我的经验是2000片段连接8个小时，3000片段连接12个小时。效果一直很好，我用的就是pmd19和solution one，挑点的时候可以适当多挑几个，片段越长，假阳性越多。希望能对你有帮助

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2楼2015-01-13 22:48:50
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普通回帖

kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 494118250 at 2015-01-13 22:48:50
不知道你的片段多长，我的经验是2000片段连接8个小时，3000片段连接12个小时。效果一直很好，我用的就是pmd19和solution one，挑点的时候可以适当多挑几个，片段越长，假阳性越多。希望能对你有帮助
...

我的片段是1500bp，以前也做过室温半小时连的很好~~~我挑了80个了，都是这样。如果要是没有连上载体的话，会长出来很多白斑吗？我是构建文库的，如果效率太低也没有办法用。
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3楼2015-01-14 13:00:15
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kittykbh(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:07:56
用M13引物扩增出来的有一段载体序列，如果扩增得到的片段在150bp左右，那基本都是载体序列，基因没有连到载体上。
你跑电泳跑的时间太短了，marker都没有分开，可以跑远一点再看看。
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4楼2015-01-14 13:16:35
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kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuderong at 2015-01-14 13:16:35
用M13引物扩增出来的有一段载体序列，如果扩增得到的片段在150bp左右，那基本都是载体序列，基因没有连到载体上。
你跑电泳跑的时间太短了，marker都没有分开，可以跑远一点再看看。

已经用尽了方法，就是连不上，换了更好的载体也连不上，每次p都是这个效果。只要没在1500bp地方，基本上就再跑也是废品了呀。。。
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5楼2015-01-15 10:27:03
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liyaodong164

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段的质量是成败的关键，尽量提高其纯度和浓度。纯度尤为重要，假阳性基本都是混入的小片段，因其更易连接，虽然胶上看不见，数量未必少，所以假阳性会高。
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6楼2015-01-15 10:44:05
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416114799

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
分子的东西，问题不好解释。涉及步骤太多，哪怕一个小步骤你没注意就不行了。我之前啥分子没做过，一次就成功了。你说你的板，没有蓝色菌落？正常的肯定有几个的吧！从pcr开始检查，是否有条带。切胶回收我们用的xygen。我觉得你最大的问题是感受态的问题？？？

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做人做事要低调,默默践行心中的梦想.
7楼2015-01-15 11:02:11
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kittykbh at 2015-01-15 10:27:03
已经用尽了方法，就是连不上，换了更好的载体也连不上，每次p都是这个效果。只要没在1500bp地方，基本上就再跑也是废品了呀。。。...

再核对一下你的引物接头对不对，酶切位点有没有突变？是否和载体对应得上？看能不能换一下酶切位点？按理说酶切连接不会那么难。
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8楼2015-01-15 11:31:54
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kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liyaodong164 at 2015-01-15 10:44:05
片段的质量是成败的关键，尽量提高其纯度和浓度。纯度尤为重要，假阳性基本都是混入的小片段，因其更易连接，虽然胶上看不见，数量未必少，所以假阳性会高。

谢谢指点，还想继续请教一下，切胶时候切下来纯化的目的条带是1500bp，理论上还能混入小片段吗？
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9楼2015-01-15 13:26:02
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kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 416114799 at 2015-01-15 11:02:11
分子的东西，问题不好解释。涉及步骤太多，哪怕一个小步骤你没注意就不行了。我之前啥分子没做过，一次就成功了。你说你的板，没有蓝色菌落？正常的肯定有几个的吧！从pcr开始检查，是否有条带。切胶回收我们用的xy ...

谢谢解答，我没有做蓝白筛选，因为是建库需要大量阳性克隆，如果只有几个阳性克隆就是失败，何况现在还一条都没有。感受态是invitrogen TOPO TA克隆对应的 TOP10(chemical),切胶的目的条带是非常明亮的。
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10楼2015-01-15 13:28:55
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