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TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp 已有6人参与
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小妹真心无语了，时隔半年还是同样的结果，之前用的是takara的pmd19-T，现在换了高级的invitrogen TOPO TA clone kit，结果还是这个样子。 求助各位实验大牛。 简单介绍一下，是用mobio Powersoil DNA提取土壤总DNA，然后扩的27f-1492r全长，虽然有点小拖带，但是p出来的主带还是够明亮的，能看出来是一条直线。 用的omgea gel extraction kit做的切胶回收。然后连接转化，氨苄青霉素钠自己溶解的粉末100mg/ul, 板子白色菌落正常，没有糊满板，都是零星单菌落，每板大概50-100个单菌落。 挑菌做菌落pcr， 如下图所示： 其中下板比较亮的是我用Sigma设计的 M13-47/RV-M， 上面小板比较弱的是TOPO自带引物一对M13，结果全都是150bp。 按理说invitrogen TOPO TA克隆用过的人都说不会有几个假阳性的，我这个看起来就是全部假阳性，包括之前做的Takara的载体的情况如出一辙。 我现在觉得是我自己的问题，但是又不清楚是哪个环节出现了问题，或者纯化后的PCR产物有自带载体自连的什么物质？ 之前在国内用的天根一套没有一点问题，我现在纠结了这么久，真的快崩溃了~~~  TOPO TA clone.jpg |
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liuderong
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