应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp
51/1返回列表
查看: 3084  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

kittykbh

铜虫 (正式写手)

[求助] TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp 已有6人参与

小妹真心无语了，时隔半年还是同样的结果，之前用的是takara的pmd19-T，现在换了高级的invitrogen TOPO TA clone kit，结果还是这个样子。
求助各位实验大牛。

简单介绍一下，是用mobio Powersoil DNA提取土壤总DNA，然后扩的27f-1492r全长，虽然有点小拖带，但是p出来的主带还是够明亮的，能看出来是一条直线。
用的omgea gel extraction kit做的切胶回收。然后连接转化，氨苄青霉素钠自己溶解的粉末100mg/ul, 板子白色菌落正常，没有糊满板，都是零星单菌落，每板大概50-100个单菌落。
挑菌做菌落pcr， 如下图所示：

其中下板比较亮的是我用Sigma设计的 M13-47/RV-M， 上面小板比较弱的是TOPO自带引物一对M13，结果全都是150bp。

按理说invitrogen TOPO TA克隆用过的人都说不会有几个假阳性的，我这个看起来就是全部假阳性，包括之前做的Takara的载体的情况如出一辙。

我现在觉得是我自己的问题，但是又不清楚是哪个环节出现了问题，或者纯化后的PCR产物有自带载体自连的什么物质？

之前在国内用的天根一套没有一点问题，我现在纠结了这么久，真的快崩溃了~~~

TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp
TOPO TA clone.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-01-13 22:00:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 494118250 at 2015-01-13 22:48:50
不知道你的片段多长，我的经验是2000片段连接8个小时，3000片段连接12个小时。效果一直很好，我用的就是pmd19和solution one，挑点的时候可以适当多挑几个，片段越长，假阳性越多。希望能对你有帮助
...

我的片段是1500bp，以前也做过室温半小时连的很好~~~我挑了80个了，都是这样。如果要是没有连上载体的话，会长出来很多白斑吗？我是构建文库的，如果效率太低也没有办法用。
赞一下 回复此楼
3楼2015-01-14 13:00:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答

494118250

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kittykbh(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:07:42
不知道你的片段多长，我的经验是2000片段连接8个小时，3000片段连接12个小时。效果一直很好，我用的就是pmd19和solution one，挑点的时候可以适当多挑几个，片段越长，假阳性越多。希望能对你有帮助

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2015-01-13 22:48:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kittykbh(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:07:56
用M13引物扩增出来的有一段载体序列，如果扩增得到的片段在150bp左右，那基本都是载体序列，基因没有连到载体上。
你跑电泳跑的时间太短了，marker都没有分开，可以跑远一点再看看。
赞一下 回复此楼
4楼2015-01-14 13:16:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kittykbh

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liuderong at 2015-01-14 13:16:35
用M13引物扩增出来的有一段载体序列，如果扩增得到的片段在150bp左右，那基本都是载体序列，基因没有连到载体上。
你跑电泳跑的时间太短了，marker都没有分开，可以跑远一点再看看。

已经用尽了方法，就是连不上，换了更好的载体也连不上，每次p都是这个效果。只要没在1500bp地方，基本上就再跑也是废品了呀。。。
赞一下 回复此楼
5楼2015-01-15 10:27:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 oeyPlfmMUpOC 2026-09-26 3/150 2026-09-27 09:13 by 4IW0sJvtEqX8
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:44 by XgCC8uTcwILl
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:42 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:39 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:32 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:08 by XgCC8uTcwILl
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:05 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:56 by XgCC8uTcwILl
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 05:56 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 5/250 2026-09-27 05:53 by XgCC8uTcwILl
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:50 by XgCC8uTcwILl
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 5/250 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 6/300 2026-09-27 05:42 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 PGTSwSC3F6nQ 2026-09-24 5/250 2026-09-25 11:19 by yhq9807
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 PGTSwSC3F6nQ 2026-09-24 7/350 2026-09-25 11:18 by yhq9807
[硕博家园] 上海工程技术大学 激光智能制造课题组 2027级博士研究生招生 +4 oxidpl 2026-09-20 6/300 2026-09-24 20:40 by oxidpl
[教师之家] 课题组招2027级博士 上海工程技术大学 激光智能制造方向 +4 oxidpl 2026-09-20 6/300 2026-09-24 20:37 by oxidpl
[基金申请] 师弟论文见刊大半年才想起来申请专利，还能抢救一下吗？ +4 13108017953 2026-09-21 4/200 2026-09-24 10:06 by kudofaye
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭