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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个基因做TA克隆后送去测序，不同的单克隆后来结果不一致，1500bp里有的11个碱基不同
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pser2011

银虫 (小有名气)

[求助] 一个基因做TA克隆后送去测序，不同的单克隆后来结果不一致，1500bp里有的11个碱基不同 已有5人参与

金唯智公司测的。基因序列未知，这可用那个构建表达载体呀，大神有知道解决办法的，救命啊！
看了氨基酸的序列，多数单克隆间氨基酸序列一致，这样的话随便挑一个单克隆做还是有什么挑选的规则？

[ Last edited by pser2011 on 2014-3-10 at 21:26 ]
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花儿也在努力地开放！
1楼 2014-03-10 21:03:47
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-03-11 09:40:22
这差异有点多，你是用什么酶扩的，普通Taq保真性很差，再一个序列分析时要看看测序峰图看看输出的序列对否，测序引物后端50bp左右和测序末端质量很差尽量舍去。
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hehe
2楼2014-03-10 22:23:45
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pser2011(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-16 14:42:31
有几个细节可能引起上述问题：
1. PCR，尽量用保真性好的酶（其实普通Taq酶，一般1.5kb也就可能引起1-2个碱基突变），适当提高退火温度；

2. 如果切胶回收片段，尽量减短紫外照射时间，很可能引起较多突变；

3. 测序结果，最好自己根据峰图拼接选择。
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做一个阳光、开朗的小和尚
3楼2014-03-11 10:51:46
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pser2011(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-03-16 14:42:52
1.对于这种情况，首先看一下测序的峰图，确定是否是单峰，是不是背景杂峰比较多，测序公司会把背景杂峰较高的反应也算作成功反应的。
2.将测序结果翻译成蛋白质序列，到NCBI的数据库中去blast，然后看是否有完全一致的比对结果，选择有完全一致比对结果的序列进行后续克隆

一般来说，Taq聚合酶的突变率不会有这么高，1500bp有1到2个克隆算是正常。出现多个测序结果的情况，可能是由于测序结果不好（杂峰导致序列差异），或者是模板不纯（混有多个基因组等），PCR的退火温度太低(45-50度)。

如果可能的话，可以使用Pfu等高保真的酶再做一下
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4楼2014-03-11 11:00:49
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pser2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-03-10 22:23:45
这差异有点多，你是用什么酶扩的，普通Taq保真性很差，再一个序列分析时要看看测序峰图看看输出的序列对否，测序引物后端50bp左右和测序末端质量很差尽量舍去。

takara的primerSTAR GXL 据说是高保真的，那些差异的碱基峰图我也看了，很清晰没有背景干扰。是模板的问题？我的模板是cDNA，几次单克隆重复间测序的结果并不是明显的分成两种，如果根据这个测序结果的话，我这模板简直就是个混合物呀，   翻译成氨基酸序列的话有两个氨基酸的差异，很多碱基变化并没有引起氨基酸变，这有没有可能是大肠杆菌里质粒复制的时候产生这么多变异？
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花儿也在努力地开放！
5楼2014-03-14 14:00:03
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pser2011

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaozhibozhi at 2014-03-11 10:51:46
有几个细节可能引起上述问题：
1. PCR，尽量用保真性好的酶（其实普通Taq酶，一般1.5kb也就可能引起1-2个碱基突变），适当提高退火温度；

2. 如果切胶回收片段，尽量减短紫外照射时间，很可能引起较多突变；

...

你好，感谢你的应助。酶我用的takara的 primerSTAR GXL,算是高保真的，57度退火，产物没有切胶直接纯化的，测序结果我看的也没有问题，还得找其他原因呀。这个真不好整，未知因素太多，谢谢。 另外，氨基酸序列一样的话，核酸序列不一样，用其中一个做克隆有没有影响？
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花儿也在努力地开放！
6楼2014-03-14 14:06:00
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by pser2011 at 2014-03-14 14:06:00
你好，感谢你的应助。酶我用的takara的 primerSTAR GXL,算是高保真的，57度退火，产物没有切胶直接纯化的，测序结果我看的也没有问题，还得找其他原因呀。这个真不好整，未知因素太多，谢谢。 另外，氨基酸序列一样 ...

做表达的话，一般问题不大
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做一个阳光、开朗的小和尚
7楼2014-03-15 19:26:15
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
提RNA的植物材料，若是从很多植株取样混合提取的，会不会存在SNP呢？
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
8楼2014-03-15 22:20:22
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2007090351

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这个是很早的帖子了，不知道LZ最后是怎么解决的？是两个克隆都做了表达呢？还是随便挑选了一个？
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9楼2014-10-11 14:54:51
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xiao99ming

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

测序质量考虑过吗？
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10楼2014-11-15 15:07:12
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