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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 如何克隆一段1200bp的真核基因，序列来自NCBI
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)

[求助] 如何克隆一段1200bp的真核基因，序列来自NCBI

想从黑曲霉中提取一种酶的基因，从NCBI已查找到所需基因的序列，但是宿主菌株与我们的不同。因此想通过已查到的基因序列设计引物，来PCR从我们菌株提取的DNA，进而检测我们的菌株是不是也产这种酶。这段基因序列长度是1257bp,含有两个内含子区,而且这段序列内部含有我们所加的酶切位点。通过软件primer primer5设计的引物都不是从两端开始的，现在不知道怎样设计引物来克隆这段序列的全长？？
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1楼 2012-10-07 10:42:38
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bintaurus

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一个方法是RACE PCR
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2楼2012-10-07 13:04:02
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天空2011

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-07 17:25:47
个人感觉没必要P那么长，只是验证一下有没有这个基因可以设计一下引物P个五六百bp就可以了，所以引物没从两头开始也没关系的，另外用酶切位点的话应该不可以与其本身含的酶切位点相同，最好换一下酶切位点，要想p全长的话可以再两端各取20bp让后加上酶切位点和保护碱基，个人见解，希望对你有所帮助
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wei_suzhen
3楼2012-10-07 15:15:22
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 天空2011 at 2012-10-07 15:15:22
个人感觉没必要P那么长，只是验证一下有没有这个基因可以设计一下引物P个五六百bp就可以了，所以引物没从两头开始也没关系的，另外用酶切位点的话应该不可以与其本身含的酶切位点相同，最好换一下酶切位点，要想p全 ...

谢谢，如果像你说的“设计一下引物P个五六百bp"是不是用primer5.0设计引物？如果p出来的序列不是我们想要的序列（即我们的黑曲霉中没有这个基因），想通过基因改造来获得我们想要的基因，一般怎么进行基因改造？一般引物的长度包括酶切位点和保护碱基吗?
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4楼2012-10-07 20:44:14
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天空2011

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wei_suzhen at 2012-10-07 20:44:14
谢谢，如果像你说的“设计一下引物P个五六百bp"是不是用primer5.0设计引物？如果p出来的序列不是我们想要的序列（即我们的黑曲霉中没有这个基因），想通过基因改造来获得我们想要的基因，一般怎么进行基因改造 ...

引物设计可以用软件设计如DNAman等，也可以自己根据序列设计，如果p不出来的话就如你所说没有这个基因，没有这个基因就没法进行PCR扩增，因为你没材料，可以通过基因合成或者像其他人要一下含有这个基因的菌株在进行pcr扩增
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5楼2012-10-07 23:33:47
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
设计兼并引物（巢式）做RACE。再麻烦点儿就是做一个cDNA文库，该基因钓出。
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6楼2012-10-08 07:09:47
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)
普通211学校的专业硕士（两年）女生，如果考名校的博士，导师会介意专业硕士吗？一般博士读几年？
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7楼2012-10-11 21:42:49
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逆天打酱油

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

BLAST一下蛋白看保守区是神马，然后对照着设计下引物，可能要分段
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8楼2013-03-05 18:24:09
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