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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆基因，挑克隆拿去测序，好多点突怎么办！？
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伤何处

木虫 (正式写手)

[求助] 克隆基因，挑克隆拿去测序，好多点突怎么办！？

两个基因都挑了11个送去测序，之前PCR扩增是22个循环扩的，然后连接载体转化。。测序结果显示，每条都有很多点突怎么办？用的是ExTaq酶

[ Last edited by 伤何处 on 2012-12-13 at 21:15 ]
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伤何处

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1楼2012-12-13 21:05:59
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你用的是模板扩增序列然后连接送测序的，
首先，你要保证原始模板没有突变，否则你做PCR时是肯定会有突变的
其次，你需要用高保真的酶，比如pfu, Kod等，楼主的PCR循环控制的很好
祝楼主成功！
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2楼2012-12-13 21:21:35
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
伤何处: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-13 22:04:41
ExTaq不具有校对活性，比较容易出错的。
建议使用高保真酶，如pfu， Pyrobest，phusion等。采用高保真酶，扩增30个循环以内，一般还是可以保证不出错的。
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3楼2012-12-13 21:45:17
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpeng227 at 2012-12-13 21:45:17
ExTaq不具有校对活性，比较容易出错的。
建议使用高保真酶，如pfu， Pyrobest，phusion等。采用高保真酶，扩增30个循环以内，一般还是可以保证不出错的。

我是从cDNA扩增的，直接用pfu可以么？师兄说pfu很难扩出来
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4楼2012-12-13 22:04:21
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 伤何处 at 2012-12-13 22:04:21
我是从cDNA扩增的，直接用pfu可以么？师兄说pfu很难扩出来...

是的，从cDNA里面扩增的，还是用ExTaq比较好，既然有突变，那就能这样了，接下来，你可以将不同克隆之间没有突变的部分拼接起来，酶切的方法，overlap的方法，还有你要查清楚，你所讲的突变，发生率是否高，是不是SNP造成的，如果确定是突变，就想办法把突变修正回来
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5楼2012-12-13 23:11:15
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伤何处

木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
嗯嗯，现在我也怀疑是snp因为有几个点一半是这个碱基另一半是另外个……搞得我很纠结o>_
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6楼2012-12-13 23:28:19
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
伤何处: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢，那我用pfu的扩增试一下？ 2012-12-14 09:42:53
SNP的概率是1/1000，如果一个PCR产物里很多点突变，应该不仅仅是SNP的原因。

Taq酶系列扩增<500bp
pfu扩增500-3000bp
taq+pfu扩增更长的，或者有一款LA系列的酶吧

上面是我自己做实验的经验。
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行至水穷处，坐看云起时
7楼2012-12-14 09:30:15
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wangpeng227

木虫 (小有名气)
不用那么费劲，直接pfu扩增就行，做了就知道能不能扩出来了，一般1000-2000还是可以的。
可以适当调整下退火温度，实在不行还可以加一点镁离子。
当然phusion比较好用，虽然有点贵。
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8楼2012-12-14 11:25:36
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gyesang

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引用回帖:
6楼: Originally posted by 伤何处 at 2012-12-13 23:28:19
嗯嗯，现在我也怀疑是snp因为有几个点一半是这个碱基另一半是另外个……搞得我很纠结o>_<o

NCBI有个SNP数据库，你可以到那里面去查一下看看
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9楼2012-12-14 12:29:55
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伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wangpeng227 at 2012-12-14 11:25:36
不用那么费劲，直接pfu扩增就行，做了就知道能不能扩出来了，一般1000-2000还是可以的。
可以适当调整下退火温度，实在不行还可以加一点镁离子。
当然phusion比较好用，虽然有点贵。

嗯嗯，谢了~我试试~
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10楼2012-12-14 13:23:44
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