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伤何处

木虫 (正式写手)

[求助] 克隆基因,挑克隆拿去测序,好多点突怎么办!?

两个基因都挑了11个送去测序,之前PCR扩增是22个循环扩的,然后连接载体转化。。测序结果显示,每条都有很多点突怎么办?用的是ExTaq酶

[ Last edited by 伤何处 on 2012-12-13 at 21:15 ]
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主你用的是模板扩增序列然后连接送测序的,
首先,你要保证原始模板没有突变,否则你做PCR时是肯定会有突变的
其次,你需要用高保真的酶,比如pfu, Kod等,楼主的PCR循环控制的很好
祝楼主成功!
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-12-13 21:21:35
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
伤何处: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-13 22:04:41
ExTaq不具有校对活性,比较容易出错的。
建议使用高保真酶,如pfu, Pyrobest,phusion等。采用高保真酶,扩增30个循环以内,一般还是可以保证不出错的。
3楼2012-12-13 21:45:17
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伤何处

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpeng227 at 2012-12-13 21:45:17
ExTaq不具有校对活性,比较容易出错的。
建议使用高保真酶,如pfu, Pyrobest,phusion等。采用高保真酶,扩增30个循环以内,一般还是可以保证不出错的。

我是从cDNA扩增的,直接用pfu可以么?师兄说pfu很难扩出来
对也罢,错也罢;正也罢,逆也罢;通途也好,崎岖无妨……但问,吾心坚否?若坚,纵使歧路,以铁心,贯穿而过,亦为大道!不坚,便是坦途,也难登临绝顶,观险峰
4楼2012-12-13 22:04:21
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 伤何处 at 2012-12-13 22:04:21
我是从cDNA扩增的,直接用pfu可以么?师兄说pfu很难扩出来...

是的,从cDNA里面扩增的,还是用ExTaq比较好,既然有突变,那就能这样了,接下来,你可以将不同克隆之间没有突变的部分拼接起来,酶切的方法,overlap的方法,还有你要查清楚,你所讲的突变,发生率是否高,是不是SNP造成的,如果确定是突变,就想办法把突变修正回来
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2012-12-13 23:11:15
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伤何处

木虫 (正式写手)

送鲜花一朵
嗯嗯,现在我也怀疑是snp因为有几个点一半是这个碱基另一半是另外个……搞得我很纠结o>_
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6楼2012-12-13 23:28:19
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
伤何处: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢,那我用pfu的扩增试一下? 2012-12-14 09:42:53
SNP的概率是1/1000,如果一个PCR产物里很多点突变,应该不仅仅是SNP的原因。

Taq酶系列扩增<500bp
pfu扩增500-3000bp
taq+pfu扩增更长的,或者有一款LA系列的酶吧

上面是我自己做实验的经验。
行至水穷处,坐看云起时
7楼2012-12-14 09:30:15
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

不用那么费劲,直接pfu扩增就行,做了就知道能不能扩出来了,一般1000-2000还是可以的。
可以适当调整下退火温度,实在不行还可以加一点镁离子。
当然phusion比较好用,虽然有点贵。
8楼2012-12-14 11:25:36
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gyesang

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引用回帖:
6楼: Originally posted by 伤何处 at 2012-12-13 23:28:19
嗯嗯,现在我也怀疑是snp因为有几个点一半是这个碱基另一半是另外个……搞得我很纠结o>_<o

NCBI有个SNP数据库,你可以到那里面去查一下看看
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
9楼2012-12-14 12:29:55
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伤何处

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by wangpeng227 at 2012-12-14 11:25:36
不用那么费劲,直接pfu扩增就行,做了就知道能不能扩出来了,一般1000-2000还是可以的。
可以适当调整下退火温度,实在不行还可以加一点镁离子。
当然phusion比较好用,虽然有点贵。

嗯嗯,谢了~我试试~
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10楼2012-12-14 13:23:44
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