应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆基因，挑克隆拿去测序，好多点突怎么办！？
51/1返回列表
查看: 2080  |  回复: 21
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

伤何处

木虫 (正式写手)

[求助] 克隆基因，挑克隆拿去测序，好多点突怎么办！？

两个基因都挑了11个送去测序，之前PCR扩增是22个循环扩的，然后连接载体转化。。测序结果显示，每条都有很多点突怎么办？用的是ExTaq酶

[ Last edited by 伤何处 on 2012-12-13 at 21:15 ]
回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

伤何处

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
1楼2012-12-13 21:05:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wangpeng227 at 2012-12-14 11:25:36
不用那么费劲，直接pfu扩增就行，做了就知道能不能扩出来了，一般1000-2000还是可以的。
可以适当调整下退火温度，实在不行还可以加一点镁离子。
当然phusion比较好用，虽然有点贵。

嗯嗯，谢了~我试试~
赞一下 回复此楼
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
10楼2012-12-14 13:23:44
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 22 个回答

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你用的是模板扩增序列然后连接送测序的，
首先，你要保证原始模板没有突变，否则你做PCR时是肯定会有突变的
其次，你需要用高保真的酶，比如pfu, Kod等，楼主的PCR循环控制的很好
祝楼主成功！
赞一下 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2012-12-13 21:21:35
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
伤何处: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-12-13 22:04:41
ExTaq不具有校对活性，比较容易出错的。
建议使用高保真酶，如pfu， Pyrobest，phusion等。采用高保真酶，扩增30个循环以内，一般还是可以保证不出错的。
赞一下 回复此楼
3楼2012-12-13 21:45:17
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

伤何处

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangpeng227 at 2012-12-13 21:45:17
ExTaq不具有校对活性，比较容易出错的。
建议使用高保真酶，如pfu， Pyrobest，phusion等。采用高保真酶，扩增30个循环以内，一般还是可以保证不出错的。

我是从cDNA扩增的，直接用pfu可以么？师兄说pfu很难扩出来
赞一下 回复此楼
对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
4楼2012-12-13 22:04:21
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 22 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭